Введение
В последние десятилетия в России проблема алкоголизации нации является одной из наиболее актуальных [1-3]. О ее государственной значимости дополнительно свидетельствует специализированная Президентская программа, реализующаяся в последние годы [1; 4]. При этом большая часть алкогользависимых пациентов – лица трудоспособного возраста, утрачивающие в результате заболевания профессиональные способности и навыки, а также возможность реализовывать трудовой потенциал [2; 3; 5]. Более того, длительное постоянное употребление спиртных напитков проводит к формированию многочисленных осложнений со стороны практически всех органов и систем [5; 6]. В связи с этим профилактика алкоголизации населения и адекватное лечение данного контингента пациентов являются основной задачей современной наркологии.
Известно, что алкогольная абстиненция представляет собой симптомокомплекс соматических, неврологических и психопатологических расстройств у больного алкоголизмом, возникающих в результате внезапного прекращения запоя или снижения доз алкоголя [5-7]. Формирующиеся при этом выраженные и резкие метаболические и функциональные перестройки предопределяют целесообразность своевременной и полноценной коррекции данного патологического состояния, однако эффективность существующих лечебных алгоритмов остается недостаточно высокой [7-9]. В полной мере это касается и восстановления параметров системной и локальной гемодинамики, а также устранения метаболических сдвигов [10]. На этом основании сохраняет свою актуальность поиск и изучение клинических перспектив инновационных технологий. Одной из таковых является системная озонотерапия, включающая внутривенное введение предварительно озонированного физиологического раствора, оказывающего комплексный эффект (непосредственная окислительная деструкция токсических соединений, купирование окислительного стресса, стимуляция микроциркуляции, коррекция энергодефицита и др.) [6; 7]. С другой стороны, для достижения максимальной эффективности курса озонотерапевтического лечения принципиальную значимость имеет персонификация дозировки озона, однако методы ее осуществления практически отсутствуют, а успешность коррекции оценивается лишь по динамике отдельных лабораторных параметров по окончании лечения [8; 9]. Данная задача может быть решена путем использования разработанного авторами ранее биокристалломного претеста, базирующегося на предварительном (до начала курса озонотерапии) изучении результата сокристаллизации плазмы крови пациента с физиологическим раствором, насыщенным различными концентрациями озона.
Целью данного исследования служил анализ тезиграфических и биохемилюминесцентных параметров плазмы крови пациентов с алкогольным абстинентным синдромом в условиях озонирования in vitro.
Материал и методы исследования
Исследование было проведено на образцах крови 18 пациентов с алкогольным абстинентным синдромом (F10.222 по МКБ-10) (средний возраст обследуемых лиц – 44,1±4,3 года). У всех испытуемых до начала комплексной терапии осуществляли получение образцов крови в объеме 4 мл, из них выделяли плазму методом дифференциального центрифугирования по стандартному протоколу.
Для проведения экспериментов были использованы свежеприготовленные образцы 0,9% раствора хлорида натрия (физиологического раствора), причем создавали 7 образцов, различающихся по насыщающей концентрации озона. Первый был контрольным (без обработки), второй и последующие получены после барботажа физиологического раствора озоно-кислородной смесью с концентрациями озона 1000, 3000, 6000, 10000, 20000 и 40000 мкг/л соответственно [11].
Генерацию озоно-кислородной смеси производили с помощью озонатора «Медозонс-систем» (Нижний Новгород), скорость насыщения физиологического раствора составляла 30 мкг/л*мин., длительность барботажа до достижения необходимой дозы соединения – 3-5 мин.
Непосредственно биокристалломный претест выполняли путем внесения аликвотного объема озонированного (или контрольного) физиологического раствора в каплю биологической жидкости на предметном стекле в соотношении 1:1. После завершения процесса дегидратации капли и формирования дефинитивной тезиграфической фации результат структуризации оценивали визуально (по образованным морфологическим элементам) и визуаметрически (с использованием комплекса балльных полуколичественных критериев). В качестве наиболее значимых показателей использовали основной тезиграфический коэффициент Q, а также степень деструкции фации (СДФ) [12; 13].
Вторым компонентом анализа ответа биосистемы на озонирование служила оценка состояния окислительного метаболизма плазмы крови, которую осуществляли с применением технологии Fe-индуцированной биохемилюминесценции, реализуемой на биохемилюминометре «БХЛ-06» (Нижний Новгород). Наиболее информативными интегральными параметрами, согласно данному методу, являлись интенсивность свободнорадикальных процессов, отражающая светосумму хемилюминесценции, и суммарная активность антиоксидантных систем в биологической жидкости.
Статистическую обработку данных производили с помощью программы SPSS 11.0. Нормальность распределения значений параметров оценивали с использованием критерия Шапиро-Уилка. Для оценки статистической значимости различий применяли Н-критерий Краскела-Уоллиса. Различия считали достоверными при уровне значимости p<0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
Выполненное морфологическое и визуаметрическое исследование тезиграмм сформированных систем «плазма крови – озонированный физиологический раствор» позволило подтвердить стереотипный и немонотонный характер реагирования биообъектов на воздействие активных форм кислорода. В частности, анализ графиков изменения основного тезиграфического коэффициента Q (рис. 1) и степени деструкции фации (рис. 2) свидетельствует о наличии двухфазной зависимости, имеющей единый экстремум. Данная точка перегиба для обследуемых пациентов с алкогольной абстиненцией соответствует насыщающей концентрации озона 10000 мкг/л.
Рис. 1. Инициаторный потенциал плазмы крови при обработке разными насыщающими концентрациями озона (по коэффициенту Q)
Ранее авторами были выполнены эксперименты с аналогичным дизайном на образцах крови практически здоровых людей, позволившие определить, что экстремум тезиграфических показателей в этом случае находится в области более низких значений – в районе 4000-5000 мкг/л [13]. Для биологической жидкости пациентов с алкогольным абстинентным синдромом фиксировали плавное нарастание уровня параметра Q при увеличении насыщающей концентрации озона с 1000 до 10000 мкг/л (рис. 1), что указывает на усиление детоксикационного эффекта воздействия в данном диапазоне доз соединения. Важно отметить, что дальнейший прирост количества активных форм кислорода приводит к резкому снижению коэффициента Q, который уже в следующей использованной концентрации (20000 мкг/л) опускается ниже контрольного уровня (p<0,05). Это косвенно свидетельствует об образовании избыточного количества свободных радикалов, потенцирующих окислительный стресс в биосреде.
Рис. 2. Степень деструкции фации плазмы крови при обработке разными насыщающими концентрациями озона (по коэффициенту Q)
Сходная картина ответа на озонирование раскрывается и на основании анализа степени «разрушенности» и сформированности отдельных элементов тезиграмм плазмы крови рассматриваемого контингента пациентов (рис. 2). Установлено, что экстремум соответствующего графика также соответствует насыщающей концентрации 10000 мкг/л. В данной точке уровень показателя не отличается от контрольных значений, а для остальных использованных в эксперименте концентраций соединения – статистически значимо превышает его (p<0,05). Интересно, что как при минимальной дозе озона (1000 мкг/л), слабо модифицирующей субстраты интоксикации, так и при максимальной насыщающей концентрации (40000 мкг/л), выраженно пополняющей пул свободных радикалов в биосреде, была зафиксирована выраженная деструкция структурных элементов тезиграфической фации. Сопряженность приведенной динамики тезиграфических параметров дополнительно подтверждается обнаружением выраженной корреляционной зависимости между ними (r=–0,80±0,07; p<0,01).
Авторы предполагают, что установленный двухфазный характер ответа биосреды на воздействие озона обусловлен влиянием изменяющегося уровня свободных радикалов на протеом плазмы крови, причем умеренное пополнение пула радикальных молекул обеспечивает стабилизацию белкового компонента биосреды, а гиперпродукция может приводить к стимуляции процессов агрегации и потере нативной конфигурации, что создает условия для ингибирования кристаллогенеза [14; 15]. Именно на эти тенденции указывает обнаруженная динамика основного тезиграфического коэффициента и степени деструкции фации.
Рис. 3. Интенсивность свободнорадикальных процессов плазмы крови при обработке разными насыщающими концентрациями озона
Также в рамках настоящего эксперимента выполнена оценка влияния, включающая как мониторинг интенсивности свободнорадикальных процессов (рис. 3), так и общую антиоксидантную активность (рис. 4).
Рис. 4. Общая антиоксидантная активность плазмы крови при обработке разными насыщающими концентрациями озона
Выявлено, что все использованные концентрации озона обеспечивают снижение интенсивности липопероксидации, и данная зависимость, в отличие от представленных на рисунках 1 и 2, носит монотонный характер. В то же время экстремум также обнаруживался при насыщающей концентрации озона 10000 мкг/л, которой соответствовало минимальное значение интенсивности индуцированной биохемилюминесценции и, следовательно, максимальное ингибирование свободнорадикальных процессов. Дальнейшее повышение количества вводимых активных форм кислорода, напротив, способствовало более высокой интенсивности перекисного окисления липидов в биожидкости.
Динамика суммарной антиоксидантной активности плазмы крови пациентов с алкогольной абстиненцией закономерно оказалась обратной относительно интенсивности свободнорадикальных процессов в биологической жидкости (рис. 4). Установлено, что максимальный (оптимальный) уровень общей антиоксидантной активности, как и по остальным рассмотренным основным показателям, выявлен при использовании физиологического раствора с насыщающей концентрацией озона 10000 мкг/л. В этом случае антиоксидантный потенциал возрастает в 2,08 раза относительно контрольного уровня (p<0,01), что позволяет наиболее полно купировать формирующийся при алкогольной интоксикации окислительный стресс. Иные примененные насыщающие концентрации озона обеспечивали существенно менее выраженный антиоксидантный эффект в образцах плазмы крови обследуемых людей.
Заключение
Установлено, что различные концентрации озона при введении в плазму крови существенно и дозозависимо трансформируют картину инициированного кристаллогенеза биологической жидкости и параметры ее окислительного метаболизма, причем данная зависимость носит нелинейный характер и имеет выраженный экстремум. Показано, что в образцах пациентов с алкогольным абстинентным синдромом данный экстремум соответствует насыщающей концентрации 10000 мкг/л, что превышает уровень, характерный для образцов плазмы крови практически здоровых людей.