Scientific journal

Modern problems of science and education

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

Как известно, неблагоприятная демографическая ситуация в современной России приобретает масштабы острейшей проблемы не только медико-социального, но и общегосударственного характера, что неоднократно озвучивалось высшими лицами руководства нашего государства. Тот факт, что уже в течение трех десятилетий население РФ не может достигнуть уровня 1993 года, говорит о критическом состоянии здоровья страны на популяционно-национальном уровне [1].

Одним из ключевых условий решения вышеназванной проблемы, безусловно, являются медико-профилактические мероприятия, направленные на охрану здоровья женщин репродуктивного возраста и детей. В частности, мониторинг совокупного соматического статуса полиорганизменного репродуктивного комплекса: беременная-плод, а также в дальнейшем - новорожденного ребенка (как и матери), является одной из фундаментальных медико-социальных задач, направленных на оптимизацию демографического профиля России XXI века. Внутриутробная гипоксия плода и гипоксия новорожденных является одной из основных причин тяжелых осложнений состояния ребенка и ранней его инвалидизации в родовом, послеродовом и раннем грудном периодах. Успешное предотвращение подобных состояний предполагает поиск новых адекватных биохимических маркеров гипоксемии для своевременной адекватной диагностики гипоксических состояний [2-4].

Особый интерес в этом плане представляют стадиоспецифические антенатальные изотипы гемоглобиновой системы, а именно: плодовый (фетальный, HbF) и примитивный (эмбриональный, HbE) гемоглобины. При хроническом устойчивом снижении парциального давления кислорода, приводящем к гипоксии на тканевом уровне, в крови плода отмечается рост концентрации HbF, что, по мнению ряда авторов, объясняется непосредственным воздействием выраженной длительной гипоксемии на индукцию генов названного антенатального типа гемоглобина и, соответственно, активации его синтеза [5-7]. Данный феномен, очевидно, носит компенсаторно-адаптивный характер, поскольку важнейшим свойством HbF является более выраженная тропность к О2, нежели у гемоглобина взрослого (HbA1). Это важнейшее качество позволяет тетрамерам HbF энергично отнимать кислород от молекул HbA1 материнской крови и обеспечивать тем самым адекватную оксигенацию тканей эмбриона или плода [6-8].

Замечательным является тот факт, что у HbE, как и у HbF, сродство к кислороду значительно выше, чем у гемоглобинов взрослого человека.

Основываясь на приведенных выше фактах, можно сделать логичное предположение о вовлечении в процесс компенсации тяжелой внутриутробной гипоксии не только HbF, но и HbE. Поэтому исследование примитивного гемоглобина, безусловно, представляет интерес как в теоретическом, так и в практическом отношении, поскольку в перспективе позволит понять механизмы, регулирующие пролиферацию и дифференцировку кроветворных клеток, выявить компенсаторные возможности организма, что дает основу для разработки клинико-диагностических алгоритмов при гипоксических состояниях.

В свете вышесказанного экспериментальное подтверждение диагностической значимости HbE и HbF, как маркеров гипоксии, и создание новых надежных, точных и специфичных диагностических тестов на эти белки является актуальной задачей.

Следует отметить, что исследования по разработке оригинальных точных и селективных способов определения HbF, а также (в меньшей степени) HbE ведутся уже не одно десятилетие [7; 9; 10].

Цель исследования: иммунохимическая индикация примитивного и плодового типов гемоглобина в пуповинной крови новорожденных с тяжелой степенью внутриутробной гипоксии при сопутствующих заболеваниях, для анализа роли этих белков как маркеров гипоксии.

Материал и методы исследования

Сбор клинического материала проводился в ГБУЗ «Клинический родильный дом имени Ю.А. Пасхаловой» г. Астрахани.

Клинический анализ изучаемых нозологических форм проводился при участии квалифицированных врачей-акушеров.

Объектом исследования служила пуповинная гепаринизированная кровь новорожденных детей. Всего было обследовано 497 образцов пуповинной крови, полученной от новорожденных детей с письменного согласия их матерей (табл. 1).

Таблица 1

Перечень материала по группам

Степень тяжести гипоксического состояния оценивалась квалифицированными неонатологами с использованием методик шкал Silverman и Downes, рентгенологических данных, специальных лабораторных исследований, а также общей оценки объективного состояния новорожденного.

Анализ изучаемых протеинов проводили на базе научной лаборатории кафедры биологической химии и КЛД ФГБОУ ВРО «Астраханский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ.

Концентрацию HbF в исследуемых пробах определяли по авторской методике путем разгона в агаровом геле ракетным электрофорезом биоматериала, обработанного раствором додецилсульфата натрия (ДСН) (патент № 2310204. от 10.11.2007) [9; 10]; порог чувствительности метода 1,71±0,29 мг/л. Индикацию HbE проводили полуколичественной методикой иммунопреципитации по Оухтерлони; порог чувствительности тест-системы – 3,75±0,05 мг/л. Количественное определение HbE осуществляли путем радиальной иммунодиффузии по Манчини; порог чувствительности – 2,28±0,04 мг/л. Для количественного и качественного анализа применяли моноспецифические антисыворотки на HbE и HbF, полученные самостоятельно. Иммунохимические тесты и соответствующие калибровочные кривые по вышеописанным методикам смоделированы самостоятельно [7; 9; 10].

Статистический анализ результатов работы проводили при помощи лицензионной программы Excel-2016 с использованием общепринятых показателей: средней (М), среднего отклонения (m), значимости соизмеримых различий (р), критерия Стьюдента (t), показателя дисперсии F и корреляционного анализа Пирсона (коэффициент корреляции - r).

Результаты исследования и их обсуждение

Данное исследование проводилось с 2019 по 2024 г., но следует указать, что приводимые данные являются совокупным итогом анализа проводимых ранее работ [7; 10], расширенных и дополненных современными результатами.

А. Определение HbF

Развернутое количественное иммунохимическое определение HbF в клиническом материале показало значительное статистически значимое отклонение средних значений концентраций HbF в крови новорожденных в исследуемых группах по отношению к группе сравнения, а именно: ВГТС - повышение на 30,23%, ВГТС в сочетании с ЗВУР - повышение на 70,46%, и менее выраженное, но значимое повышение уровня HbF при внутриутробной гипоксии средней тяжести (табл. 2). Статистическая значимость изменения среднего уровня HbF при внутриутробной гипоксии легкой степени является сомнительной.

Таблица 2

Результаты количественного определения HbF у новорожденных

Исследуемые группы	n	Концентрация HbF (мг/л)	Коэффициент дисперсии (F)	Критерий Стьюдента (t)
Здоровые дети	84	1093,8±62,8	3,91
Внутриутробная гипоксия легкой степени	66	1134±48,4	4,03	1,76 р>0,05
Внутриутробная гипоксия средней степени	79	1223±70,8	4,15	3,68 р<0,05
Внутриутробная гипоксия тяжелой степени	207	1433,6±71,5	5,19	4,51 р<0,05
ВГТС в сочетании с задержкой внутриутробного развития (ЗВУР)	61	1852,1±97,3	5,64	6,23 р<0,05

Межгрупповая степень свободы = 2.

Стандартное отклонение (σ) по генеральной совокупности 49,3.

На основе полученных данных впервые выявлена высокая положительная корреляция между средней концентрацией HbF в крови и степенью тяжести гипоксии новорожденных (r = 0,88).

Проведен гендерный анализ средних показателей HbF в исследуемой клинической выборке у новорожденных девочек и мальчиков (табл. 3).

Таблица 3

Средние показатели уровня HbF у новорожденных девочек и мальчиков

Исследуемые группы	Концентрация HbF (мг/л)		F
	Пол		Пол
	Мужской	Женский	Мужской	Женский
Здоровые новорожденные	1077,1±49,2 р<0,05	1211,4±75,0 р<0,05	4,68	3,84
Новорожденные с ВГТС	1422,6±51,3 р<0,05	2306,9±92,3 р<0,01	4,77	4,86

Межгрупповая степень свободы = 3.

Стандартное отклонение (σ) по генеральной совокупности 68,9.

Приведенные данные свидетельствуют о явной зависимости продукции HbF от пола ребенка, наиболее выраженной при внутриутробной гипоксии тяжелой степени. И если средние величины уровня HbF в крови у здоровых новорожденных женского пола превышают таковые у новорожденных мужского пола на 12,44%, то удельное преимущество средних концентраций HbF у новорожденных женского пола в группе с гипоксией тяжелой степени составляет 64,44%.

Б. Определение HbE

Данные качественного иммунохимического тестирования 497 образцов клинического материала на HbE позволили показать, что этот самый ранний онтогенетический тип гемоглобина человека, как и следовало ожидать, не определяется в крови здоровых детей и пациентов с различными формами гипоксии новорожденных легкой и средней степени тяжести.

В крови детей с ВГТС положительные реакции на примитивный гемоглобин регистрировали в 29,4% случаев.

Проведен сравнительный иммунохимический анализ частоты определения HbE в крови новорожденных девочек и мальчиков. Следует отметить, что полученные результаты во многом сходны с таковыми по плодовому гемоглобину, а именно: в ходе данного исследования показана математически значимая разница частоты индикации HbE в крови новорожденных с ВГТС по гендеру: у детей женского пола этот показатель в 1,9 раза превышал таковой у детей мужского пола (табл. 4).

Таблица 4

Частота выявления HbE у новорожденных с ТВГ

Пол	Число обследованных	Число положительных тестов на HbE	Частота выявления (в %)
Мальчики	105	20	19,0
Девочки	99	40	40,4
Всего	204	60	29,4

Межгрупповая степень свободы = 2.

Коэффициент дисперсии (F) по генеральной совокупности 7,6.

Величина значимости различий в сопоставляемых выборках мальчиков и девочек была удовлетворительной (р<0,05).

Определение концентрации HbE методом радиальной иммунодиффузии по Манчини проводилось только в исследуемых пробах с положительным тестом на этот протеин. Средняя концентрация примитивного гемоглобина в крови новорожденных с ВГТС с позитивным выявлением равнялась 3,80±0,22 мг/л; среди них у новорожденных женского пола - 3,97±0,25 мг/л; мужского - 3,64±0,17 мг/л.

По мнению авторов, существенное повышение количества исследуемых гемопротеинов в пуповинной крови при ВГТС можно объяснить отмеченным ранее фактом: HbE и HbF, будучи стадиоспецифическими белками, работающими в антенатальном периоде развития человека, в условиях физиологической гипоксии плода (или эмбриона) имеют бо́льшую тропность к O2, чем гемоглобин взрослого. Именно это качество позволяет данным белкам извлекать кислород от материнского гемоглобина в тканях плаценты и успешно транспортировать его в ткани плода/эмбриона, обеспечивая адекватную оксигенацию. Как оказалось, описанное свойство HbE и HbF играет существенную биологическую роль оптимизации тканевого дыхания не только в условиях физиологической, но и при патологической внутриутробной гипоксемии и тканевой гипоксии. Вероятно, гипоксия тяжелой степени является триггером, активирующим процессы индукции соответствующих генов (гены γ-цепи (HbF) и ε-цепи (HbE) гемоглобина), что опосредованно приводит к повышению концентрации HbF и появлению HbE в крови плода и, соответственно, способствует более эффективному отбору кислорода из материнской крови, обеспечивая, таким образом, адекватный перенос O2 и достаточную оксигенацию тканей плода [5; 7; 8].

Очевидно, увеличение уровня изучаемых белков в крови плода при внутриутробной гипоксии тяжелой степени является мощным адаптивным механизмом, оптимизирующим газообмен в тканях плода в условиях выраженного дефицита кислорода [9; 10].

Выраженный дисбаланс частоты индикации HbE и средних значений уровня HbF в крови новорожденных женского и мужского пола с ВГТС, по мнению авторов, объясняется более высокими компенсаторными возможностями женского организма как в общем, так и в системе «эритрон – кровь – тканевое дыхание» [7].

Заключение

Показана диагностическая ценность фетального и эмбрионального гемоглобинов человека как маркеров тяжелой внутриутробной гипоксии новорожденных. Моделирование эффективных иммунохимических тестов на плодовый и примитивный гемоглобины и внедрение их в клиническую практику, безусловно, дополнит общепринятые диагностические панели по внутриутробной гипоксии новорожденных тяжелой степени и оптимизирует диагностику, прогноз и оценку качества лечения.