Нарушение консолидации переломов костей скелета является актуальной проблемой в мировой травматологии, достигая глобальной распространенности в 9 млн случаев в год. Ограниченные возможности терапии и диагностики нарушения регенерации кости по-прежнему приводят к тому, что пациенты живут с постоянной болью. Достигая уровня 5–10% от общего числа переломов и 23% для определенных сегментов конечностей, нарушение консолидации входит в десятку причин, наиболее значимо снижающих качество жизни, по данным последних исследований [1, 2].
Одной из наиболее важных проблем в данном вопросе является поздняя диагностика. Как правило, диагностика нарушения консолидации переломов происходит на сроке 3–9 месяцев, что в значительной степени усложняет и ограничивает выбор терапии, сводя все методики лечения к хирургическим [1]. С этой точки зрения все больший интерес ученых представляет изучение генетически детерминированных клеточных и иммунных взаимодействий в месте перелома, нарушение которых происходит гораздо раньше появления клинических признаков нарушения консолидации. Основой для начала процесса регенерации является формирование так называемого адаптивного гомеостаза, призванного сформировать баланс между провоспалительными и противовоспалительными факторами в месте формирования будущей мозоли. В эксперименте показано, что дисбаланс этих факторов как в ту, так и в другую сторону закономерно приводит к замедлению или нарушению консолидации [2]. Таким образом, определение уровня провоспалительных цитокинов могло бы способствовать оценке качества репаративного процесса. Однако нельзя не учитывать то факт, что генетически детерминированный механизм в разных популяциях может качественно отличаться. Яркими примерами такого явления могут являться полиморфизм генов, таких как: гаплотип BMP4 (rs2761884, rs17563, rs2071047, rs762642; GTAA); генотип T/G (rs3753793) в гене CYR61; генотип C/T или T/T по SNP rs2853550 в гене IL1B, генотип C/T или T/T по rs2297514 и генотип A/G или G/G по rs2248814 в гене NOS2, которые повышают риск нарушения консолидации [3]. Таким образом, исследование полиморфизма генов цитокинов и их влияния на содержание кодируемых белков представляется актуальной задачей, что и явилось целью нашего исследования.
Цель исследования – определить воздействие SNP IL1β-3953C>Т, IL6-174C>G на синтез кодируемых белков у пациентов с замедленной консолидацией переломов длинных костей нижних конечностей в Забайкальском крае.
Материалы и методы исследования
В работе с обследуемыми лицами соблюдались этические принципы, предъявляемые Хельсинкской декларацией Всемирной Медицинской Ассоциации (World Medical Association Declaration of Helsinki 1964, 2013 – поправки) и «Правилами клинической практики в Российской Федерации», утвержденными приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 г. № 266.
Проведено обследование 108 неродственных пациентов русской национальности в возрасте 18–44 лет с переломами длинных костей нижних конечностей, проживающих в Забайкальском крае. Первая группа – 62 пациента в возрасте 34,5 [18; 44] года с неосложненным течением переломов длинных костей нижних конечностей (группа клинического сравнения); вторая группа – 46 пациентов с замедленной консолидацией переломов в возрасте 36,0 [18; 44] лет.
Контрольная группа (n=92) – респонденты, сопоставимые по возрасту (18–44 лет по ВОЗ), полу, месту проживания и национальности.
Критерии исключения: наличие родственных связей; пациенты с острыми и/или хроническими сопутствующими заболеваниями, другими патологическими состояниями/травмами, хроническим алкоголизмом; пациенты и респонденты с дефектами оказания медицинской помощи (недостаточное «анатомичное» сопоставление костных отломков при репозиции, повторные оперативные вмешательства), а также лица, получавшие антирезорбтивную терапию и препараты кальция.
Распределение пациентов по группам осуществляли согласно локализации и характеру переломов длинных костей нижних конечностей. Для этого использовали классификацию «Ассоциации остеосинтеза» (АО) [4]. Группы пациентов с переломами были сопоставимы по полу, возрасту, обстоятельствам травмы, локализации, характеру перелома и проводимому лечению.
Генетические исследования осуществляли путем определения мутации IL1β-3953C>Т и IL6-174C>G, используя наборы праймеров «Литех»-«SNP» (Россия). Концентрацию IL-1β и IL-6 в сыворотке крови устанавливали с помощью тест-систем ЗАО «Вектор-Бест» (Россия) методом иммуноферментного анализа.
Клинические, лабораторные и инструментальные (рентгенография) исследования осуществляли через 2 месяца после травмы. Для оценки признаков консолидации использовали шкалу RUST [5] (табл. 1).
Таблица 1
Шкала для оценки консолидации переломов
|
*Количественное значение (ЕД) |
1 |
2 |
3 |
|
Линия перелома |
Прослеживается |
Прослеживается |
Нет |
|
Костная мозоль |
Нет |
Есть |
Есть |
Примечание: * – количественное значение устанавливается для медиального, латерального, переднего и заднего кортикального слоев большеберцовой кости (перелом консолидированный – 10 и более баллов).
Рентгенологические признаки окончательной консолидации характеризовали следующими параметрами: равномерная и непрерывная кальцинация мозоли, достигающей большей плотности, чем у здоровой кости; абсорбция и консолидация наружной мозоли; заполнение пространства между отломками непрерывными перекладинами.
Статистическую обработку результатов исследования осуществляли с помощью пакета программ IBM SPSS Statistics Version 25.0 (лицензия № Z125-3301-14, IBM, США). При проведении статистического анализа авторы руководствовались принципами Международного комитета редакторов медицинских журналов (ICMJE) и рекомендациями «Статистический анализ и методы в публикуемой литературе» (SAMPL) [6, 7]. Оценку нормальности распределения признаков проводили с помощью W-критерия Шапиро–Уилка. С учетом распределения признаков, отличного от нормального, интервальные данные представлены в виде медианы, первого и третьего квартилей (Me [Q1; Q3]). Статистическая значимость различий показателей между группами оценивалась путем определения U-критерия Манна–Уитни и уровня значимости p. Во всех случаях р<0,05 считали статистически значимым. Оценку статистической значимости различий номинальных показателей исследования проводили с использованием критерия χ2 Пирсона. Зависимость относительных показателей оценивали путем сравнения полученного значения критерия χ2 с критическим (определяли уровень значимости p) [8].
Результаты исследования и их обсуждение. При определении встречаемости аллелей и генотипов генов IL1β-3953C>Т и IL6-174C>G у больных с замедленной консолидацией переломов установлено, что генотип -174G/G гена IL6 позволяет прогнозировать данное осложнение ввиду обнаружения связи его носительства с развитием данного патологического состояния (р=0,01). Напротив, при выявлении частоты встречаемости генотипов гена IL1β-3953C>Т достоверной разницы в исследуемых группах не отмечено (табл. 2, 3).
Таблица 2
Частота SNP IL1β-3953C>Т у больных с замедленной консолидацией переломов (χ2, df=2)
|
|
Контроль (n=92) |
1-я группа (n=62) |
2-я группа (n=46) |
|
-3953С- OR [95% CI] |
0,880 |
0,879 0,99 [0,49–1,99] |
0,859 0,83 [0,40–1,72] |
|
-3953T- OR [95% CI] χ2 u u1 |
0,120 |
0,121 1,01 [0,50–2,04] 0,00 0,97 |
0,141 1,21 [0,58–2,53] 0,26 0,61 0,66 |
|
-3953СС OR [95% CI] |
0,804 |
0,806 1,01 [0,45–2,29] |
0,783 0,88 [0,37–2,09] |
|
-3953СT OR [95% CI] |
0,152 |
0,145 0,95 [0,38–2,34] |
0,152 1,00 [0,37–2,68] |
|
-3953TT OR [95% CI] χ2 u u1 |
0,043 |
0,048 1,12 [0,24–5,18] 0,03 0,98 |
0,065 1,53 [0,33–7,17] 0,3 0,86 0,92 |
Примечание: u – значимость различий с контролем; u1 – значимость различий с 1-й группой.
Таблица 3
Частота SNP IL6-174C>G у больных с замедленной консолидацией переломов (χ2, df=2)
|
|
Контроль (n=92) |
1-я группа (n=62) |
2-я группа (n=46) |
|
-174С- OR [95% CI] |
0,560 |
0,556 0,99 [0,62–1,56] |
0,370 0,46 [0,28–0,77] |
|
-174G- OR [95% CI] χ2 u u1 |
0,440 |
0,444 1,01 [0,64–1,60] 0,00 0,95 |
0,630 2,17 [1,30–3,63] 8,88 0,003 0,007 |
|
-174СС OR [95% CI] |
0,326 |
0,323 0,98 [0,49–1,96] |
0,174 0,44 [0,18–1,05] |
|
-174СG OR [95% CI] |
0,467 |
0,468 1,00 [0,53–1,91] |
0,391 0,73 [0,36–1,50] |
|
-174GG OR [95% CI] χ2 u u1 |
0,207 |
0,210 1,02 [0,46–2,25] 0,00 1,0 |
0,435 2,96 [1,37–6,39] 8,63 0,01 0,03 |
Примечание: p – значимость различий с контролем; р1 – значимость различий с 1-й группой.
Следующим этапом проведено определение концентрации кодируемых цитокинов (IL-1β, IL-6) у исследуемых групп. Показано, что их содержание у пациентов с неосложненным течением переломов превышало значения контроля и группы с нарушением консолидации в 1,5, 1,4 и в 1,7 и 1,2 раза соответственно (табл. 4). Уровень исследуемых цитокинов в группе с замедленной консолидацией также находился выше контрольных значений, подтверждая роль IL-1β и IL-6 в патогенезе нарушения консолидации переломов [9].
Таблица 4
Содержание цитокинов (IL-1β, IL-6) в исследуемых группах на 2-й месяц после травмы
|
Группа Показатель |
Контроль |
1-я группа |
2-я группа
|
|
IL-1β (пг/мл) |
5,99 (1,72; 10,61) |
9,04 (4,78; 16,87) u<0,001 |
6,62 (3,68; 12,98) u=0,005 u1<0,001 |
|
IL-6 (пг/мл) |
5,07 (0,23; 10,07) |
8,58 (0,39; 13,74) u<0,001 |
6,89 (0,39; 12,9) u=0,008 u1=0,008 |
Примечание: u – значимость различий с контролем; u1 – значимость различий с 1-й группой.
При выявлении воздействия SNP IL1β-3953C>Т и IL6-174C>G на синтез кодируемых белков обнаружено, что при носительстве генотипа -3953C/Т и генотипа -3953T/Т гена IL1β во всех исследуемых группах отмечается повышение синтеза IL-1β. В свою очередь, генотип -174C/G и генотип -174G/G гена IL6, напротив, ассоциировались со снижением синтеза IL-6 (табл. 5, 6).
Таблица 5
Концентрация IL-1β в зависимости от SNP IL1β-3953C>Т
|
Генотип Группа |
-3953СС |
-3953СT |
-3953TT |
|
Контроль (n=92)
|
5,28 (3,91; 6,32) (n=74) |
7,73 (7,51; 7,93) (n=14) u=0,041 |
10,22 [9,77; 10,60] (n=4) р<0,001 р1<0,001 |
|
1-я группа (n=62) |
8,13 (6,96; 9,69) (n=50) |
12,04 (11,73; 12,17) (n=9) u<0,001 |
14,01 [13,65; 15,44] (n=3) u<0,001 u1=0,011 |
|
2-я группа (n=46) |
5,92 (5,14; 7,13) (n=36) |
9,26 (8,85; 9,33) (n=7) u<0,001 |
10,78 [10,50; 11,88] (n=3) u<0,001 u1<0,06 |
Примечание: u – значимость различий с -3953СС; u1 - значимость различий с -3953СТ.
Таблица 6
Концентрация IL-6 в зависимости от SNP IL6-174C>G
|
Генотип Группа |
-174СС |
-174СG |
-174GG |
|
Контроль (n=92) |
7,04 (6,23; 7,67) (n=30) |
4,81 (4,34; 5,23) (n=43) р<0,001
|
2,09 [1,79; 2,64] (n=19) р<0,001 р<0,001 |
|
1-я группа (n=62) |
11,11 (10,36; 12,34) (n=20) |
8,31 (7,05; 8,84) (n=29) р<0,001
|
3,63 [2,99; 4,39] (n=13) р<0,001 р<0,001 |
|
2-я группа (n=46) |
10,91 (9,93; 11,99) (n=8) |
7,94 [7,13; 8,52] (n=18) р<0,001
|
3,73 [3,27; 4,48] (n=20) р<0,001 р<0,001 |
Примечание: u – значимость различий с -174СС; u1 – значимость различий с -174СG.
Увеличение содержания IL-1β и IL6 в плазме крови у пациентов с нормальным заживлением переломов и нарушением консолидации закономерно и согласуется с данными литературы [9]. Однако необходимо отметить, что в группе с замедленной консолидацией содержание IL-1β и IL6 было ниже, чем в группе с нормальным заживлением перелома, что может свидетельствовать об активации процессов ремоделирования в группе клинического сравнения [10].
Наличие генотипа -3953C/С гена IL1β и генотипов -174C/G, -174G/G гена IL6 продемонстрировало статистически значимую тенденцию к снижению содержания кодируемых белков (IL-1β, IL-6) в плазме крови. Снижение их концентрации и нарушение процессов репарации переломов объяснимы, поскольку IL-6, как и IL-1β, являясь катаболическим цитокином [11], стимулирует продукцию RANKL, таким способом увеличивая остеокластогенез ипроцессы остеорезорбции. Можно сделать вывод, что если происходит угнетение IL-1β, IL-6, то происходит угнетение и активности макрофагов и уменьшается костная резорбция [12], что очень важно на начальном этапе репаративной регенерации. Кроме того, снижение уровня IL-6 влияет и на его стимулирующее действие при высвобождении фактора роста эндотелия сосудов, что снижает возможности васкуляризации. Эксперименты in vitro показали, что IL-6 способствует экспрессии остеогенных белков RUNX2 и остеокальцина и, как следствие, стимулирует дифференцировку остеобластов [9].
Уровень IL-6 у пациентов с различными типами переломов возвращается к норме примерно через 6 месяцев после травмы, что свидетельствует о его решающей роли в содействии заживлению тканей, остеогенной регенерации на ранней стадии повреждения костной ткани и может быть использовано в качестве раннего маркера заживления переломов [9]. Можно предполагать, что полиморфизм гена IL6-174G/G вносит существенный вклад в замедленную консолидацию переломов и может служить ранним диагностическим маркером в прогнозировании данного осложнения.
Таким образом, установление SNP цитокинов и их воздействия на концентрацию кодируемых белков расширяет понимание механизмов замедленной консолидации при переломах костей конечностей и, возможно, в будущем будет содействовать доклинической диагностике и своевременной профилактике нарушения репаративной регенерации.
Выводы
1. У пациентов с благоприятным течением переломов на 60-е сутки после травмы регистрируется повышение IL-1β и IL-6 в плазме крови.
2. Наличие генотипа -3953C/С гена IL1β и генотипа -174G/G гена IL6 способствует снижению содержания кодируемых белков (IL-1β, IL-6).
3. Наличие генотипа -174G/G гена IL6 ассоциировано с риском развития нарушения консолидации.