Нарушение консолидации переломов костей скелета является актуальной проблемой в мировой травматологии, достигая глобальной распространенности в 9 млн случаев в год. Ограниченные возможности терапии и диагностики нарушения регенерации кости по-прежнему приводят к тому, что пациенты живут с постоянной болью. Достигая уровня 5–10% от общего числа переломов и 23% для определенных сегментов конечностей, нарушение консолидации входит в десятку причин, наиболее значимо снижающих качество жизни, по данным последних исследований [1, 2].

Одной из наиболее важных проблем в данном вопросе является поздняя диагностика. Как правило, диагностика нарушения консолидации переломов происходит на сроке 3–9 месяцев, что в значительной степени усложняет и ограничивает выбор терапии, сводя все методики лечения к хирургическим [1]. С этой точки зрения все больший интерес ученых представляет изучение генетически детерминированных клеточных и иммунных взаимодействий в месте перелома, нарушение которых происходит гораздо раньше появления клинических признаков нарушения консолидации. Основой для начала процесса регенерации является формирование так называемого адаптивного гомеостаза, призванного сформировать баланс между провоспалительными и противовоспалительными факторами в месте формирования будущей мозоли. В эксперименте показано, что дисбаланс этих факторов как в ту, так и в другую сторону закономерно приводит к замедлению или нарушению консолидации [2]. Таким образом, определение уровня провоспалительных цитокинов могло бы способствовать оценке качества репаративного процесса. Однако нельзя не учитывать то факт, что генетически детерминированный механизм в разных популяциях может качественно отличаться. Яркими примерами такого явления могут являться полиморфизм генов, таких как: гаплотип BMP4 (rs2761884, rs17563, rs2071047, rs762642; GTAA); генотип T/G (rs3753793) в гене CYR61; генотип C/T или T/T по SNP rs2853550 в гене IL1B, генотип C/T или T/T по rs2297514 и генотип A/G или G/G по rs2248814 в гене NOS2, которые повышают риск нарушения консолидации [3]. Таким образом, исследование полиморфизма генов цитокинов и их влияния на содержание кодируемых белков представляется актуальной задачей, что и явилось целью нашего исследования.

Цель исследования – определить воздействие SNP IL1β-3953C>Т, IL6-174C>G на синтез кодируемых белков у пациентов с замедленной консолидацией переломов длинных костей нижних конечностей в Забайкальском крае.

Материалы и методы исследования

В работе с обследуемыми лицами соблюдались этические принципы, предъявляемые Хельсинкской декларацией Всемирной Медицинской Ассоциации (World Medical Association Declaration of Helsinki 1964, 2013 – поправки) и «Правилами клинической практики в Российской Федерации», утвержденными приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 г. № 266.

Проведено обследование 108 неродственных пациентов русской национальности в возрасте 18–44 лет с переломами длинных костей нижних конечностей, проживающих в Забайкальском крае. Первая группа – 62 пациента в возрасте 34,5 [18; 44] года с неосложненным течением переломов длинных костей нижних конечностей (группа клинического сравнения); вторая группа – 46 пациентов с замедленной консолидацией переломов в возрасте 36,0 [18; 44] лет.

Контрольная группа (n=92) – респонденты, сопоставимые по возрасту (18–44 лет по ВОЗ), полу, месту проживания и национальности.

Критерии исключения: наличие родственных связей; пациенты с острыми и/или хроническими сопутствующими заболеваниями, другими патологическими состояниями/травмами, хроническим алкоголизмом; пациенты и респонденты с дефектами оказания медицинской помощи (недостаточное «анатомичное» сопоставление костных отломков при репозиции, повторные оперативные вмешательства), а также лица, получавшие антирезорбтивную терапию и препараты кальция.

Распределение пациентов по группам осуществляли согласно локализации и характеру переломов длинных костей нижних конечностей. Для этого использовали классификацию «Ассоциации остеосинтеза» (АО) [4]. Группы пациентов с переломами были сопоставимы по полу, возрасту, обстоятельствам травмы, локализации, характеру перелома и проводимому лечению.

Генетические исследования осуществляли путем определения мутации IL1β-3953C>Т и IL6-174C>G, используя наборы праймеров «Литех»-«SNP» (Россия). Концентрацию IL-1β и IL-6 в сыворотке крови устанавливали с помощью тест-систем ЗАО «Вектор-Бест» (Россия) методом иммуноферментного анализа.

Клинические, лабораторные и инструментальные (рентгенография) исследования осуществляли через 2 месяца после травмы. Для оценки признаков консолидации использовали шкалу RUST [5] (табл. 1).

Таблица 1

Шкала для оценки консолидации переломов

Примечание: * – количественное значение устанавливается для медиального, латерального, переднего и заднего кортикального слоев большеберцовой кости (перелом консолидированный – 10 и более баллов).

Рентгенологические признаки окончательной консолидации характеризовали следующими параметрами: равномерная и непрерывная кальцинация мозоли, достигающей большей плотности, чем у здоровой кости; абсорбция и консолидация наружной мозоли; заполнение пространства между отломками непрерывными перекладинами.

Статистическую обработку результатов исследования осуществляли с помощью пакета программ IBM SPSS Statistics Version 25.0 (лицензия № Z125-3301-14, IBM, США). При проведении статистического анализа авторы руководствовались принципами Международного комитета редакторов медицинских журналов (ICMJE) и рекомендациями «Статистический анализ и методы в публикуемой литературе» (SAMPL) [6, 7]. Оценку нормальности распределения признаков проводили с помощью W-критерия Шапиро–Уилка. С учетом распределения признаков, отличного от нормального, интервальные данные представлены в виде медианы, первого и третьего квартилей (Me [Q1; Q3]). Статистическая значимость различий показателей между группами оценивалась путем определения U-критерия Манна–Уитни и уровня значимости p. Во всех случаях р<0,05 считали статистически значимым. Оценку статистической значимости различий номинальных показателей исследования проводили с использованием критерия χ2 Пирсона. Зависимость относительных показателей оценивали путем сравнения полученного значения критерия χ2 с критическим (определяли уровень значимости p) [8].

Результаты исследования и их обсуждение. При определении встречаемости аллелей и генотипов генов IL1β-3953C>Т и IL6-174C>G у больных с замедленной консолидацией переломов установлено, что генотип -174G/G гена IL6 позволяет прогнозировать данное осложнение ввиду обнаружения связи его носительства с развитием данного патологического состояния (р=0,01). Напротив, при выявлении частоты встречаемости генотипов гена IL1β-3953C>Т достоверной разницы в исследуемых группах не отмечено (табл. 2, 3).

Таблица 2

Частота SNP IL1β-3953C>Т у больных с замедленной консолидацией переломов (χ2, df=2)

Примечание: u – значимость различий с контролем; u1 – значимость различий с 1-й группой.

Таблица 3

Частота SNP IL6-174C>G у больных с замедленной консолидацией переломов (χ2, df=2)

Примечание: p – значимость различий с контролем; р1 – значимость различий с 1-й группой.

Следующим этапом проведено определение концентрации кодируемых цитокинов (IL-1β, IL-6) у исследуемых групп. Показано, что их содержание у пациентов с неосложненным течением переломов превышало значения контроля и группы с нарушением консолидации в 1,5, 1,4 и в 1,7 и 1,2 раза соответственно (табл. 4). Уровень исследуемых цитокинов в группе с замедленной консолидацией также находился выше контрольных значений, подтверждая роль IL-1β и IL-6 в патогенезе нарушения консолидации переломов [9].

Таблица 4

Содержание цитокинов (IL-1β, IL-6) в исследуемых группах на 2-й месяц после травмы

Примечание: u – значимость различий с контролем; u1 – значимость различий с 1-й группой.

При выявлении воздействия SNP IL1β-3953C>Т и IL6-174C>G на синтез кодируемых белков обнаружено, что при носительстве генотипа -3953C/Т и генотипа -3953T/Т гена IL1β во всех исследуемых группах отмечается повышение синтеза IL-1β. В свою очередь, генотип -174C/G и генотип -174G/G гена IL6, напротив, ассоциировались со снижением синтеза IL-6 (табл. 5, 6).

Таблица 5

Концентрация IL-1β в зависимости от SNP IL1β-3953C>Т

Примечание: u – значимость различий с -3953СС; u1 - значимость различий с -3953СТ.

Таблица 6

Концентрация IL-6 в зависимости от SNP IL6-174C>G

Примечание: u – значимость различий с -174СС; u1 – значимость различий с -174СG.

Увеличение содержания IL-1β и IL6 в плазме крови у пациентов с нормальным заживлением переломов и нарушением консолидации закономерно и согласуется с данными литературы [9]. Однако необходимо отметить, что в группе с замедленной консолидацией содержание IL-1β и IL6 было ниже, чем в группе с нормальным заживлением перелома, что может свидетельствовать об активации процессов ремоделирования в группе клинического сравнения [10].

Наличие генотипа -3953C/С гена IL1β и генотипов -174C/G, -174G/G гена IL6 продемонстрировало статистически значимую тенденцию к снижению содержания кодируемых белков (IL-1β, IL-6) в плазме крови. Снижение их концентрации и нарушение процессов репарации переломов объяснимы, поскольку IL-6, как и IL-1β, являясь катаболическим цитокином [11], стимулирует продукцию RANKL, таким способом увеличивая остеокластогенез ипроцессы остеорезорбции. Можно сделать вывод, что если происходит угнетение IL-1β, IL-6, то происходит угнетение и активности макрофагов и уменьшается костная резорбция [12], что очень важно на начальном этапе репаративной регенерации. Кроме того, снижение уровня IL-6 влияет и на его стимулирующее действие при высвобождении фактора роста эндотелия сосудов, что снижает возможности васкуляризации. Эксперименты in vitro показали, что IL-6 способствует экспрессии остеогенных белков RUNX2 и остеокальцина и, как следствие, стимулирует дифференцировку остеобластов [9].

Уровень IL-6 у пациентов с различными типами переломов возвращается к норме примерно через 6 месяцев после травмы, что свидетельствует о его решающей роли в содействии заживлению тканей, остеогенной регенерации на ранней стадии повреждения костной ткани и может быть использовано в качестве раннего маркера заживления переломов [9]. Можно предполагать, что полиморфизм гена IL6-174G/G вносит существенный вклад в замедленную консолидацию переломов и может служить ранним диагностическим маркером в прогнозировании данного осложнения.

Таким образом, установление SNP цитокинов и их воздействия на концентрацию кодируемых белков расширяет понимание механизмов замедленной консолидации при переломах костей конечностей и, возможно, в будущем будет содействовать доклинической диагностике и своевременной профилактике нарушения репаративной регенерации.

Выводы

1. У пациентов с благоприятным течением переломов на 60-е сутки после травмы регистрируется повышение IL-1β и IL-6 в плазме крови.

2. Наличие генотипа -3953C/С гена IL1β и генотипа -174G/G гена IL6 способствует снижению содержания кодируемых белков (IL-1β, IL-6).

3. Наличие генотипа -174G/G гена IL6 ассоциировано с риском развития нарушения консолидации.