Кожные раневые повреждения являются актуальной проблемой современной медицины. Согласно данным Росстата, только за 2022 год зарегистрировано 230428 случаев поверхностных повреждений и открытых ран [1]. С учетом возросшего количества вооруженных конфликтов в 2023 году ожидается кратное увеличение случаев по данной группе заболеваний. В связи с этим остро стоит проблема поиска новых эффективных средств лечения кожных ран.
Перспективным направлением лечения открытых поверхностных повреждений в настоящее время является применение синтетических раневых покрытий [2, 3]. Особое место среди всех известных раневых покрытий занимают покрытия на основе полимера молочной кислоты (полилактида) [4]. В экспериментальных исследованиях показано, что применение полилактида в качестве средства лечения открытых повреждений кожных ран позволяет значительно ускорить процесс заживления [5, 6].
В настоящее время широко применяются полилактидные полимерные покрытия, имеющие однородную фибриллярную структуру [7]. Известно, что разработана технология, позволяющая модифицировать трехмерную микроархитектонику полимера путем формирования в ней микрорезервуаров (микрокамер) [8]. Присутствие микрорезервуаров в структуре полимера позволило бы использовать их в качестве емкостей для химических веществ с физиологической активностью, влияя на течение раневого процесса.
Практическое применение полилактидного микрокамерного раневого покрытия обусловливает необходимость исследования его биосовместимости в области острой экспериментальной экцизионной кожной раны in vivo.
Цель исследования – провести морфологическую оценку биосовместимости полилактидного микрокамерного раневого покрытия при закрытии им полнослойной кожной раны.
Материалы и методы исследования
Исследование проводилось на беспородных крысах-самцах массой 180–240 г, возрастом от 6 до 12 месяцев. Животные были разделены на три группы: контрольную группу (включала 10 интактных животных), группу сравнения (включала в себя 30 крыс, которым выполнена модель острой эксцизионной кожной раны), опытную группу (30 крыс, которым выполнена модель острой эксцизионной кожной раны, но рана которых была закрыта полилактидным микрокамерным раневым покрытием).
Эксперименты над животными проводились в соответствии с Директивой Европейского парламента и Совета Европейского Союза 2010/63/ЕС от 22.09.2010 г. о защите животных, использующихся для научных целей, с Федеральным законом от 27.12.2018 № 498-ФЗ (ред. от 27.12.2019) «Об ответственном обращении с животными и о внесении изменений в отдельные законодательные акты Российской Федерации», а также с учетом рекомендаций этического комитета СГМУ (протокол № 12 от 30.06.2022 г.).
Хирургические манипуляции проводились под наркозом. Для этого использовали внутримышечное введение раствора тилетамина и золазепама (Телазол 100 мг®, производитель «Zoetis Manufacturing & Research Spain, S.L.» Carretera Camprodon s/n – LaRiba, 17813-Valle de Bianya, Gerona, Испания) из расчета 10 мг/кг (0,1 мл/кг) массы тела и ксилазина гидрохлорида (Ксиланит®, производитель ООО «Нита-Фарм», Россия) в дозе 1 мг/кг (0,05 мл/кг) массы тела.
Модель острой эксцизионной кожной раны выполнялась по общепринятой технологии [9]. После депиляции в межлопаточной области кожу трехкратно обрабатывали растворами антисептиков. При помощи квадратного трафарета 10 х 10 мм и 5%-ного раствора йода наносили разметку будущей раны. С использованием пинцета, ножниц и скальпеля проводили иссечение всей толщины эпидермиса и дермы по разметке. Крысам опытной группы на образованный кожный дефект укладывали раневое покрытие.
Технология производства микрокамерных полилактидных раневых поверхностей описана по ссылке [10]. Готовому к применению раневому покрытию ножницами придавали форму, соответствующую раневому дефекту.
Морфологическую оценку изменений в области экспериментальной эксцизионной раны проводили на 7-е и 14-е сутки исследования. Срезы толщиной 5–7 мкм окрашивали гематоксилином Майера (ООО «Биовитрум», Россия) и эозином (ООО «Биовитрум», Россия). Микроскопию препаратов зоны раневого дефекта выполняли с помощью микровизора проходящего света серии μVizo-103 (ООО «ЛОМО ФОТОНИКА», Россия). Оценивали состояние и кровенаполнение сосудов микроциркуляторного русла, инфильтрацию дна раны и ее перифокальной зоны лейкоцитами. При микроскопии срезов в 5 полях зрения при увеличении объектива х63 производили подсчет фибробластов и фиброцитов, а также макрофагов, полиморфоядерных лейкоцитов и лимфоцитов для оценки лейкоцитарной инфильтрации.
Для статистической обработки полученных результатов использовали программный пакет «Statistica 10» (StatSoft, США). Большинство данных не соответствовали закону нормального распределения, поэтому рассчитывали медиану, верхний и нижний квартили. Для сравнения полученных показателей применяли непараметрический U-критерий Манна–Уитни. Различия значений считали достоверными при p<0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
На 7-е сутки в зоне раневого дефекта у крыс группы сравнения визуализируются некротические массы, образующие струп. Края и дно раны инфильтрированы лейкоцитами. В составе лейкоцитарной инфильтрации преобладают нейтрофилы, лимфоциты и макрофаги. По сравнению с интактной дермой у крыс данной группы на 7-е сутки эксперимента увеличивается количество фибробластов, но снижается количество фиброцитов, что отражает воспалительную активацию клеток фибробластического ряда. При этом значимо увеличивается количество полиморфоядерных лимфоцитов, лимфоцитов и макрофагов (таблица).
Динамика состава клеточных популяций дна и краев острой эксцизионной кожной раны у крыс разных групп на 7-е и 14-е сутки исследования, среднее количество клеток в поле зрения при увеличении объектива х63x
|
|
Фибробласты |
Фиброциты |
Лимфоциты |
Полиморфо-ядерные лейкоциты |
Макрофаги |
|
Контроль (n=10) |
40 (20; 51) |
19 (12; 25) |
0 (0; 1) |
0 (0; 0) |
0 (0; 0) |
|
Группа сравнения 7-е сутки (n=15) |
52 (46; 64) р1 = 0,023 |
10 (7; 11) р1<0,001 |
6 (3; 10) р1 = 0,021 |
13 (4; 19) р1<0,001 |
2 (0; 5) р1 = 0,031 |
|
Группа сравнения 14-е сутки (n=15) |
47 (41; 68) р1 = 0,036 р2 = 0,607 |
9 (6; 11) р1<0,001 р2 = 0,487 |
15 (5; 21) р1<0,001 р2 = 0,025 |
2 (0; 5) р1 = 0,584 р2 <0,001 |
3 (0; 4) р1 = 0,011 р2 = 0,918 |
|
Опытная группа 7-е сутки (n=15) |
60 (51; 68) р1 = 0,002 р2 = 0,175 |
7 (5; 10) р1<0,001 р2 = 0,132 |
5 (1;8) р1<0,001 р2 = 0,463 |
3 (0; 17) р1 = 0,045 р2 = 0,017 |
3 (0; 5) р1 = 0,011 р2 = 0,799 |
|
Опытная группа 14-е сутки (n=15) |
47 (44; 55) р1 = 0,031 р3 = 0,835 р4 = 0,018 |
17 (14; 20) р1 = 0,459 р3 <0,001 р4 <0,001 |
3 (2; 4) р1 =0,019 р3 <0,001 р4 = 0,966 |
0 (0; 0) р1 = 0,901 р3 = 0,632 р4 = 0,031 |
2 (0; 4) р1 = 0,046 р3 = 0,114 р4 = 0,075 |
Примечание.
p1 – уровень значимости по сравнению с интактной дермой крыс группы контроля.
р2 – уровень значимости по сравнению с группой сравнения на 7-е сутки эксперимента.
р3 – уровень значимости по сравнению с группой сравнения на 14-е сутки эксперимента.
р4 – уровень значимости относительно значений опытной группы на 7-е сутки эксперимента.
К 14-м суткам при микроскопии в зоне раневого дефекта визуализируются некротические массы, образующие струп. По краям раневого дефекта отмечается пролиферация эпидермиса, характеризующая частичную эпителизацию раны. В перифокальной области кровеносные сосуды артериального и венозного русла имеют преимущественно повышенное кровенаполнение. В отдельных сосудах перифокальной области визуализируются явления сладжа и сепарация крови на плазму и форменные элементы. В участках соединительной ткани, близко расположенных к краю дефекта, визуализируется большое количество мелких сосудов с тонкими стенками и неравномерным кровенаполнением. Отмечается лейкоцитарная инфильтрация, преимущественно лимфоцитарная. По краю раневого дефекта в неэпителизированных участках присутствуют нейтрофилы. В тканях зоны дефекта отмечаются большое количество сидерофагов и скопления свободно лежащего гемосидерина, являющиеся признаками старых кровоизлияний.
Данные, полученные при морфометрическом анализе препаратов и представленные в таблице, свидетельствуют, что в период с 7-х по 14-е сутки динамика состава клеточных популяций соединительной ткани краев и дна дефекта кожи, не закрытого раневым покрытием, проявляется значимым уменьшением полиморфоядерных лимфоцитов в составе лейкоцитарной инфильтрации и повышением количества лимфоцитов. Изменения количества фибробластических элементов в этот период статистической значимости не достигают.
Таким образом, морфологические изменения краев раневого дефекта характеризуются воспалительными сосудистыми и тканевыми реакциями. Сосудистые реакции проявляются полнокровием сосудов перифокальной зоны с формированием множества тонкостенных сосудов с неравномерным кровенаполнением в соединительной ткани по краю раневого дефекта. Тканевые реакции характеризуются выраженной активацией клеток фибробластического ряда и лейкоцитарной инфильтрацией, в составе которой на 7-е сутки преобладают полиморфоядерные клетки, а на 14-е – лимфоциты.
При микроскопии препаратов зоны раневого дефекта животных опытной группы на 7-е сутки в некротических массах струпа не визуализируется структура покрытия. По краям раневого дефекта отмечается пролиферация эпидермиса. В перифокальной зоне визуализируется повышенное кровенаполнение сосудов артериального и венозного русла. Также в перифокальной зоне присутствуют сидерофаги до 5 в одном поле зрения. Дно и края раны умеренно инфильтрированы лейкоцитами, преимущественно лимфоцитами. В отличие от крыс группы сравнения, нейтрофильная инфильтрация неэпителизированных участков раны для животных опытной группы не характерна. В соединительной ткани дна и краев раны присутствуют единичные тонкостенные перфузируемые сосуды.
Данные, представленные в таблице, свидетельствуют, что по сравнению с интактной дермой у крыс опытной группы на 7-е сутки эксперимента увеличивается количество фибробластов, но снижается количество фиброцитов. Количественные параметры воспалительной активации клеток фибробластического ряда у животных опытной группы на 7-е сутки эксперимента не имеют значимых различий относительно группы сравнения в тот же срок наблюдения. Анализ состава лейкоцитарной инфильтрации свидетельствует, что у крыс опытной группы на 7-е сутки эксперимента значимо увеличивается количество лимфоцитов, полиморфоядерных лейкоцитов и макрофагов в соединительной ткани краев и в области дна раневого дефекта по сравнению с дермой кожи интактных крыс. При этом у крыс, которым раневой дефект закрывался микрокамерным полилактидным раневым покрытием, количество нейтрофилов в соединительной ткани дна и краев раны значимо ниже, чем у животных группы сравнения на 7-е сутки эксперимента. Значимых различий количества лимфоцитов и макрофагов у крыс опытной группы и группы сравнения на 7-е сутки эксперимента не выявлено.
В области дна и краев раны отмечается большое количество мелких сосудов с тонкими стенками и преимущественно умеренным кровенаполнением. Сосуды артериального и венозного русла в перифокальной области также характеризуются преимущественно умеренным кровенаполнением. В участках соединительной ткани в области дна раневого дефекта отмечается присутствие единичных лимфоцитов. В перифокальной области преимущественно вокруг сосудов встречаются макрофаги до 4 в поле зрения объектива х63, цитоплазма некоторых из них заполнена гемосидерином. В ходе морфометрического анализа установлено, что к 14-м суткам эксперимента у крыс опытной группы отмечались снижение количества фибробластов и повышение количества фиброцитов по сравнению с 7-ми сутками эксперимента (таблица), что указывает на дифференцировку клеток фибробластического ряда. Однако среднее количество фибробластов в соединительной ткани дна и краев раневого дефекта у крыс опытной группы на 14-е сутки эксперимента значимо превышало таковое в дерме кожи интактных животных. При этом количество фиброцитов в соединительной ткани зоны раневого дефекта у крыс данной группы значимых отличий от параметров контроля не имело. Данные, представленные в таблице, свидетельствуют, что динамика лейкоцитарной инфильтрации у крыс опытной группы в период с 7-х по 14-е сутки эксперимента проявляется значимым снижением среднего числа нейтрофилов в поле зрения объектива х63 по сравнению с таковым на 7-е сутки эксперимента. Значимой динамики количества лимфоцитов и макрофагов в соединительной ткани зоны раневого дефекта у крыс опытной группы в период с 7-х по 14-е сутки не выявлено. Относительно группы сравнения у крыс опытной группы на 14-е сутки эксперимента отмечается значимое снижение количества лимфоцитов в соединительной ткани раневого дефекта, которое все же остается выше контрольных значений.
Таким образом, под влиянием полилактидного раневого покрытия без активных компонентов у крыс опытной группы снижается выраженность лейкоцитарной инфильтрации соединительной ткани зоны дефекта кожи за счет уменьшения среднего количества нейтрофилов на 1-й неделе эксперимента и лимфоцитов на 2-й неделе. У крыс опытной группы, в отличие от животных группы сравнения, в период с 1-ю по 2-ю неделю эксперимента больше выражена дифференцировка клеток фибробластического ряда в дефинитивную форму фиброцитов. Также под влиянием микрокамерного полилактидного раневого покрытия уменьшаются морфологические признаки локальных нарушений кровотока, что проявляется нормализацией кровенаполнения как сосудов перифокальной зоны, так и мелких новообразованных сосудов в соединительной ткани зоны раневого дефекта. Влияние покрытия на кровоток в зоне регенерации более выражено на 2-й неделе эксперимента.
Заключение
После формирования острой экспериментальной экцизионной кожной раны отмечаются активация фибробластов, лейкоцитарная инфильтрация, в составе которой на 7-е сутки преобладают полиморфоядерные клетки, а на 14-е – лимфоциты, полнокровие сосудов перифокальной зоны, образование множества тонкостенных сосудов с неравномерным кровенаполнением в соединительной ткани в зоне дефекта.
Использование микрокамерного полилактидного покрытия без активных компонентов снижает лейкоцитарную инфильтрацию и способствует дифференцировке клеток фибробластического ряда в соединительной ткани зоны дефекта кожи, уменьшает морфологические признаки локальных нарушений кровотока. Указанные морфологические изменения свидетельствуют о биосовместимости микрокамерного полилактидного раневого покрытия. Данное раневое покрытие может применяться в дальнейших исследованиях с загрузкой микрорезервуаров активными веществами.