Наряду с функциональными и морфологическими изменениями в различных органах и системах экспериментальных животных, показанными, в том числе, и в нашей лаборатории [1], возникающими в ответ на воздействие солей тяжелых и цветных металлов [2], одним из базовых молекулярных механизмов патогенеза токсического влияния экотоксикантов является активация перекисного окисления липидов [3, 4]. В связи с этим актуальным является активное изучение роли антиоксидантов [5], что и определило цель нашего исследования.
Цель: изучить влияние витамина Е на перекисное окисление липидов и функциональные изменения почек у крыс при хронической кадмиевой интоксикации.
Материал и методы исследования
Эксперименты проводили в соответствии с 11-й статьей Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации, а также руководствовались правилами лабораторной практики в РФ (приказ МЗ РФ от 01.04.2016 г. № 199).
Эксперимент проведен на крысах-самцах линии Wistar (60 голов). Животные были разделены на пять групп (по 12 в каждой):
первая группа – интактный контроль (фон);
вторая группа – ежедневное внутрижелудочное введение витамина Е (200 мг/кг) в течение 30 дней (контроль № 1);
третья группа – внутрижелудочное введение подсолнечного масла (0,2 мл/100 г) в течение 30 дней (контроль № 2);
четвертая группа – ежедневное в течение 30 дней внутрижелудочное введение раствора сульфата кадмия (0,5 мг/кг);
пятая группа – ежедневное в течение 30 дней внутрижелудочное введение витамина Е (200 мг/кг) и раствора сульфата кадмия в дозе 0,5 мг/кг (через 30 минут после введения витамин Е).
Животные в течение всего эксперимента находились на стандартном рационе с доступом к воде и пище ad libitum при естественном освещении.
Раствор сульфата кадмия (0,5 мг/кг массы (в пересчете на металл)) вводили внутрижелудочно через зонд ежедневно в течение 30 дней. В качестве витамина Е использовался синтетический масляный раствор токоферола ацетата (ОАО «Самарамедпром»). В качестве второго контроля применялось обычное рафинированное подсолнечное масло (растворитель витамина Е).
Животных помещали в специальные обменные клетки для сбора мочи. Сбор мочи в отдельные емкости осуществляли в течение 6 часов. Животных забивали под тиопенталовым наркозом.
На пламенном фотометре ФАП-2 (автоматизированном) оценивали уровни калия и натрия. На спектрофотометре PV1251C-26 (наборы реагентов «АгатМед» (Россия)) исследовали концентрации креатинина, белка, кальция в моче и плазме крови. Расчет параметров водо- и электролитовыделительной функций почек проводили по классическим формулам Ю.В. Наточина.
Для оценки интенсивности перекисного окисления липидов (ПОЛ) в мембранах эритроцитов исследовали содержание малонового диальдегида (МДА) по методу В.Б. Гавриловой, основанному на взаимодействии с тиобарбитуровой кислотой и гидроперекисей (ГП). О состоянии антиоксидантной защиты (АОЗ) свидетельствовали уровень супероксиддисмутазы (СОД), который определяли с помощью аутоокисления адреналина, и степень активность каталазы (Кат), определяемая по методу E. Beutler в сыворотке крови.
Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием программы GraphPad Prizm 6.1. Нормальность распределения исследуемых параметров оценивали по критерию Шапиро–Уилка. Исходя из количества вариантов в выборке нормального распределения оцениваемых параметров плазмы крови и мочи применяли параметрическую статистику. Достоверность между группами оценивали t-критерием Стьюдента. О наличии достоверных факторных воздействий судили при р≤0,05. Также рассчитывали линейный коэффициент корреляции Пирсона с использованием программы MICROSOFT EСXEL 2010.
Результаты исследования и их обсуждение
При оценке результатов эксперимента выявлено, что внутрижелудочное введение витамина Е, равно как и аналогичного объема подсолнечного масла (как второго контроля), достоверно не изменило показателей перекисного окисления липидов. Наряду с этим витамин Е способствовал увеличению (р<0,05) активности ферментов антиоксидантной защиты в клетках: увеличилось содержание супероксиддисмутазы и каталазы (табл. 1). Ежедневное на протяжении месяца введение сульфата кадмия крысам привело к активации процессов перекисного окисления липидов клеточных мембран, о чем свидетельствует повышение (р<0,001) концентрации гидроперекисей и малонового диальдегида в мембранах эритроцитов. Под влиянием внутрижелудочного введения сульфата кадмия отмечается угнетение системы антиоксидантной системы защиты клеток, так как понизилась (р<0,001) активность и каталазы, и супероксиддисмутазы. Дополнительное к введению раствора сульфата кадмия применение витамина Е снижало (р<0,001) относительно значений в группе с изолированным введением соли металла процессы пероксидации в клетках и способствовало компенсаторному повышению (р<0,001) относительно фона и опытной группы активности каталазы и СОД (табл. 1).
Таблица 1
Изменение активности ПОЛ и АОЗ под влиянием введения витамина Е в условиях кадмиевой интоксикации
|
|
Стат. показатель |
ГП |
МДА |
СОД |
Каталаза |
|
Фон |
M±m |
4,23±0,08 |
26,2±0,12 |
77,6±0,13 |
6,23±0,21 |
|
Вит. Е (контроль 1) |
M±m |
4,4 ±0,03 |
26,12±0,058 |
79,12±0,21 |
6,95±0,02 |
|
|
р |
|
|
*) |
*) |
|
Подсолн. масло (контроль 2) |
M±m |
4,3±0,09 |
25,95±0,07 |
78,1±0,3 |
6,33±0,05 |
|
|
р |
|
|
|
|
|
CdSO4 (опытная гр.) |
M±m |
6,2±0,008 |
33,4±0,05 |
70,09±0,17 |
5,24±0,03 |
|
|
р |
*) |
*) |
*) |
*) |
|
Вит Е + CdSO4
|
M±m |
5,4±0,024 |
30,21±0,14 |
80,9±0,58 |
6,87±0,13 |
|
|
р |
*)**) |
*)**) |
*)**) |
*)**) |
Примечание. *) – к фоновым значениям; **) – к значениям в группах с изолированным введением сульфата кадмия; (вит. Е – введение витамина Е; подс. масло – введение подсолнечного масла 0,2 мл/100 г; Сd 0,5 – введение сульфата кадмия (0,5 мг/кг); Cd+вит. Е – введение сульфата кадмия (0,5 мг/кг) и витамина Е.
Интрагастральное введение синтетического раствора витамина Е и подсолнечного масла достоверно не изменило уровень диуреза в контрольных группах животных, несмотря на некоторое (р<0,05) снижение скорости клубочковой фильтрации и канальцевой реабсорбции воды (рис. 1, 2). Повреждающее действие продуктов ПОЛ в условиях кадмиевой интоксикации отразилось на функциональном уровне развитием полиурии (р<0,001), которая, очевидно, была вызвана замедлением канальцевой реабсорбции воды (р<0,001). А при сочетанном применении витамина Е и сульфата кадмия наблюдалось уменьшение 6-часового диуреза относительно группы с изолированным использованием соли кадмия (р<0,001).
Рис. 1. Изменение диуреза под влиянием введения витамина Е в условиях кадмиевой интоксикации (вит. Е – введение витамина Е; масло – введение подсолнечного масла 0,2 мл/100 г; Сd 0,5 – введение сульфата кадмия в дозе 0,5 мг/кг; Cd+вит. Е – введение сульфата кадмия (0,5 мг/кг) и витамина Е
При этом отмечалось некоторое повышение (р<0,05) канальцевой реабсорбции воды по сравнению с показателями животных с хронической затравкой кадмиевой солью, однако следует заметить, что и скорость клубочковой фильтрации у животных этой группы также увеличивалась (рис. 2).
|
|
|
Рис. 2. Изменение основных процессов мочеобразования под влиянием введения витамина Е в условиях кадмиевой интоксикации (вит. Е – введение витамина Е; масло – введение подсолнечного масла 0,2 мл/100 г; Сd 0,5 – введение сульфата кадмия в дозе 0,5 мг/кг; Cd+вит. Е – введение сульфата кадмия (0,5 мг/кг) и витамина Е
В обеих группах контроля с применением витамина Е и подсолнечного масла достоверных изменений в электролитовыделительной функции почек не наблюдалось. Внутрижелудочное введение крысам раствора сульфата кадмия вызвало резкое увеличение экскреции с мочой калия, натрия и кальция. В условиях кадмиевой интоксикации введение токоферола ацетата отразилось на экскреции ионов, приводя к уменьшению (р<0,001) относительно значений у крыс с применением только сульфата кадмия экскреции почками этих электролитов (табл. 2).
Таблица 2
Влияние витамина Е на экскрецию электролитов при внутрижелудочном введении сульфата кадмия
|
|
Стат. показатель |
Э Ca |
ЭNa |
ЭK |
|
|
|
|
||
|
мкмоль/час/100г |
||||
|
Фон
|
M±m |
0,22±0,002 |
12,45±0,01 |
5,77±0,08 |
|
Витамин Е |
M±m |
0,2±0,06 |
12,5±0,09 |
5,92±0,13 |
|
Р |
|
|
|
|
|
Подс. масло |
M±m |
0,21±0,009 |
12,41±0,08 |
5,98±0,07 |
|
Р |
|
|
|
|
|
CdSO4 0,5 мг/кг |
M±m |
0,31±0,004 |
14,2±0,06 |
8,12±0,08 |
|
Р |
*) |
*) |
*) |
|
|
Cd+вит.Е |
M±m |
0,24±0,004 |
13,2±0,11 |
7,3±0,05 |
|
Р |
*)**) |
*)**) |
*)**) |
|
Примечание. *) – к фоновым значениям; **) – к значениям в группах с изолированным введением сульфата кадмия; вит. Е – введение витамина Е; масло – введение подсолнечного масла 0,2 мл/100 г; Сd 0,5 – введение сульфата кадмия в дозе 0,5 мг/кг; Cd+вит Е – введение сульфата кадмия (0,5 мг/кг) и витамина Е.
Введение витамина Е и подсолнечного масла не изменило относительно фоновых значений выведение белка с мочой. Интрагастральное введение соли кадмия крысам на протяжении месяца привело к увеличению экскреции белка относительно фоновых значений почти в 2,5 раза. А использование сульфата кадмия на фоне внутрижелудочного введения токоферола ацетата значительно снизило (р<0,001) уровень протеинурии по сравнению с группой опытных животных с изолированным использованием соли кадмия (рис. 3).
Рис. 3. Изменение экскреции белка под влиянием введения витамина Е на фоне кадмиевой интоксикации (вит. Е – введение витамина Е; масло – введение подсолнечного масла 0,2 мл/100 г; Сd 0,5 – введение сульфата кадмия в дозе 0,5 мг/кг; Cd+вит. Е – введение сульфата кадмия (0,5 мг/кг) и витамина Е
Выводы
Таким образом, можно заключить, что:
1) введение крысам витамина Е не изменяет функциональной активности почек у крыс, не влияет на диурез и основные процессы мочеобразования;
2) токоферола ацетат не изменяет ПОЛ, но способствует активации ферментов антиоксидантной защиты;
3) введение подсолнечного масла не изменяет процессы мочеобразования и диурез у опытных животных;
4) контрольное использование подсолнечного масла у животных не вызывает изменения ПОЛ и системы АОЗ клеток;
5) кадмиевая интоксикация в течение месяца вызывает полиурию, протеинурию и увеличение экскреции электролитов с мочой, приводит к активации процессов липопероксидации и угнетению ферментной активности клеточной системы защиты;
6) дополнительное введение витамина Е на фоне использования сульфата кадмия способствует уменьшению относительно значений в группе с изолированным применением соли кадмия степени выраженности полиурии и протеинурии, уменьшению выведения электролитов и белка с мочой;
7) в условиях кадмиевой интоксикации применение витамина Е приводит на фоне снижения процессов ПОЛ к активации ферментов АОЗ клеток;
8) использование витамина Е в качестве профилактического средства кадмиевой интоксикации у крыс требует дальнейшего исследования.