Распространение по всему миру и высокий уровень заболеваемости ставит проблему изучения изменения метаболизма в развитии патологических процессов при заболевании COVID-19 в центр внимания ученых и медицинских работников. По данным ВОЗ, в 2021 году в России уровень смертности от новой коронавирусной инфекции составил 6,88%, расположив страну на 18-й позиции. В отличие от других коронавирусов, вызывающих сезонные острые респираторные заболевания, вирус SARS-COV-2 реплицируется в верхних дыхательных путях, что приводит к отсутствию у заболевших выраженной отличной клинической картины [1]. Заболевание характеризуется запоздалым иммунным ответом, перерастающим в дальнейшем в мощную иммунную реакцию, влекущую за собой патологические изменения во внеклеточных и внутриклеточных метаболических процессах [2; 3], что приводит к нарушению в процессах гемостаза, к развитию полиорганной недостаточности, ацидозу и росту риска летальности. Поэтому определение диагностической значимости биомаркеров в прогнозе развития течения COVID-19 и изучение изменений в метаболизме клеток является актуальной проблемой.
Цель исследования: определить диагностическую значимость биомаркеров крови и их манифестный характер в метаболизме патологического процесса при течении COVID-19 с учетом тяжести поражения лёгких.
Материал и методы исследования
Сбор материала для исследования проводился с октября 2020 по январь 2022 года на базе ГБУЗ «Научно-исследовательский институт – Краевая клиническая больница № 1 им. проф. С.В. Очаповского» в городе Краснодар. В качестве материала исследования (четыре экспериментальные группы) была выбрана сыворотка крови больных в возрасте от 49 до 68 лет с диагностированным COVID-19 с поражением лёгких разных степеней тяжести: легкая степень поражения (24% поражения) соответствовала результатам компьютерной томографии КТ-1 (97 человек), вторая степень поражения отмечала от 25 до 50% поврежденных участков паренхимы легких (125 человек) – КТ-2, в третью группу исследуемых из 130 человек входили пациенты с поражением легких от 50 до 75% (КТ-3), в четвертую, экспериментальную, вошли сыворотки 136 человек с поражением легочной ткани свыше 75% (КТ-4). Всего было исследовано 488 сывороток больных (все больные в процессе исследования находились в пострепродуктивном периоде, потому не были разделены на группы по половому признаку, и отличиями показателей в референтных значениях можно пренебречь) с подтвержденной новой коронавирусной инфекцией.
В контрольную группу вошла 21 сыворотка крови больных пневмонией, вызванной вирусом гриппа группы А, сопровождающаяся высоким процентом поражения легких (свыше 50%). Данный выбор группы контроля обосновывался необходимостью определения специфичности изменения биохимических маркеров крови при пневмонии, вызванной вирусом COVID-19, в сравнении с биохимическими показателями крови при пневмонии, вызванной вирусом группы А.
В ходе исследования использовались оригинальные реагенты производителей Siemens (Германия), Werfen (Испания), Abbott (США) для определения следующих биохимических показателей в сыворотке крови больных: концентрация СРБ (метод иммунотурбидиметрии с использованием латексных частиц, ƛ = 571 нм), концентрация ферритина (иммунотурбидиметрический метод, ƛ = 580 нм), концентрация ИЛ-6 (иммунохеми-люминесцентный метод); концентрация альбумина (BCG-метод) [4], концентрация лактата (колориметрический метод, ƛ = 505 нм); активность ЛДГ (УФ-кинетический метод, ƛ = 340 нм); концентрация ТГ (фотоколориметрический метод); концентрация ионов калия (ионселективный метод).
Для статистической обработки результатов исследования были использованы методы математической статистики с применением пакета прикладных программ Microsoft Excel 2013, программного комплекса Statistica v. 13.0 и онлайн-калькулятора planetcalc.ru. В результате работы были вычислены показатели среднего арифметического (X), стандартной ошибки среднего арифметического (±m), а также была определена значимость различий между показателями сравниваемых групп с помощью двухвыборочного t-критерия Стьюдента.
Результаты исследования и их обсуждение. В процессе исследования динамики изменения концентрации биохимических показателей сыворотки крови больных имели следующие особенности: наибольшая концентрация СРБ в крови пациентов была отмечена при развитии стадии, соответствующей КТ-1, и составляла 178,2±0,34 мг/л, что, возможно, связано с запуском в клетках факторов системы комплемента и активации процессов в иммунных клетках, активно вырабатывающих неспецифический белок острой фазы, призванный оказывать провоспалительный эффект. В сыворотке крови контрольной группы было отмечено повышение концентрации уровня СРБ до 98,46±0,45 мг/л. Степень поражения легких менее 25% (КТ-1) характеризовалась более высокими значениями концентрации СРБ в крови, что, вероятно, обосновывалось запоздалой, но более мощной иммунной реакцией организма на вторжение патогена. Обращает внимание то, что к четвертой стадии развития новой коронавирусной инфекции концентрация СРБ снижалась до значений 44,1±0,3 мг/л, возвращаясь в рамки референсных значений [5] или оставаясь незначительно повышенной. Такая тенденция к снижению, вероятнее всего, происходит в ответ на повышение других показателей сыворотки крови (табл.).
Биохимические показатели крови больных экспериментальных и контрольной групп
|
Группы (n – число пациентов в группах, чел.)
|
Биохимические показатели сыворотки крови (референсные значения) |
||||||||
|
СРБ (0,0-5,0 мг/л) |
Ферритин (30,0-300,0 мкг/л) |
ИЛ-6 (0,0-5,9 пг/мл) |
Альбумин (30,0-50,0 г/л) |
Лактат (0,6-2,2 ммоль/л) |
ЛДГ (130,0-250,0 Ед/л) |
ТГ (0,5-1,7 ммоль/л) |
Калий (3,5-6,5 ммоль/л) |
||
|
Контрольная группа (n=21) |
98,46 ±0,45## |
458,20 ±0,52 ## |
1,23 ±0,25## |
29,10 ±0,26**## |
1,20 ±0,28 |
364,08 ±0,35**## |
1,76 ±0,28 |
4,11 ±0,88## |
|
|
Экспери- ментальные группы (n=488) |
КТ-1 (n=97) |
178,20 ±0,34*## |
233,02 ±0,53**## |
0,23 ±0,07** |
45,10 ±0,32** |
3,12 ±0,13** |
270,30 ±0,44** |
1,77 ±0,26 |
3,90 ±0,20* |
|
КТ-2 (n=125) |
82,35 ±0,62 |
638,00 ±0,48 ** |
17,50 ±0,22** |
40,60 ±0,51 |
4,20 ±0,21 |
305,70 ±0,58 |
1,97 ±0,15** |
4,40 ±0,37 |
|
|
КТ-3 (n=130) |
47,70 ±0,55 |
980,70 ±0,72 |
338,70 ±0,21** |
34,20 ±0,47 ** |
4,20 ±0,21 |
572,90 ±0,37*## |
1,80 ±0,12 |
4,50 ±0,19 * |
|
|
КТ-4 (n=136) |
44,10 ±0,30* |
1720,00 ±0,65## |
1001,3 ±0,6**## |
29,70 ±0,42 **## |
6,43 ±0,19** |
1953,6 ±0,62 ** |
1,53 ±0,13** |
3,10 ±0,22*## |
|
|
* p≤0,01, ** p≤0,05 – уровень значимости различий концентрации биохимических показателей в сыворотках крови пациентов первой экспериментальной группы и последующей экспериментальной группы; # p≤0,01, ## p≤0,05 – уровень значимости различий концентрации биохимических показателей в сыворотках крови пациентов экспериментальной группы и контрольной группы. |
|||||||||
Рост концентрации ферритина был отмечен в сыворотке крови пациентов группы КТ-2 (638,00±0,48 мкг/л) в сравнении с концентрацией ферритина в сыворотке крови группы пациентов группы КТ-1 (p≤0,05), и значительные концентрации ферритина были отмечены в сыворотках крови больных с поражениями легочной ткани групп КТ-3 и КТ-4. На наш взгляд, такое изменение свидетельствовало о начавшемся процессе увеличения проницаемости сосудов [6], выходе иммунных клеток к месту воспаления и дальнейшей активной выработке ИЛ-6, концентрация которого стремительно значимо возрастала от невысоких значений (0,23±0,07 пг/мл) в сыворотке крови пациентов группы КТ-1 до значительных в сыворотках крови пациентов КТ-3 (338,70±0,21 пг/мл, p≤0,05), демонстрируя сформировавшийся «цитокиновый шторм» [7; 8], при котором уровень ИЛ-6 в крови больных группы КТ-4 достигал значений 1001,30±0,6 пг/мл (p≤0,05).
Концентрация альбумина сыворотки крови больных по мере развития заболевания медленно уменьшалась, однако выход концентрации за пределы нормы [6] был отмечен в сыворотке больных в терминальной стадии развития заболевания в организме (КТ-4) и составил 29,70±0,42 г/л, возможно, этот факт связан с белковым истощением организма на фоне вовлечения в процесс белков острой фазы.
Быстрый подъем и значительное повышение концентрации лактата отмечались в крови группы с поражением легких, соответствующей КТ-3, и в крови пациентов с терминальной стадией развития COVID-19 (КТ-4), свидетельствуя о быстром развитии септического процесса и наличии в организме большого количества разрушенных клеток (p≤0,05). Активность ЛДГ в сыворотке крови превышала референсные пределы в два раза у пациентов с третьей стадией (КТ-3) и составила 572,90±0,37 Ед/л, превышала в 7 раз у группы больных КТ-4 (1953,60±0,62 Ед/л), значимость различий показателей составила p≤0,05. При исследовании сывороток крови контрольной группы не наблюдалось повышения концентрации лактата. Повышение активности ЛДГ в сыворотке крови, по нашему мнению, связано с прогрессирующим деструктивным влиянием вируса на клетки организма, в том числе на клетки паренхимы лёгких. Уровень активности ЛДГ, в отличие от концентрации лактата, находящейся в пределах допустимых значений, в сыворотках крови контрольной группы возрастал, достигая уровня 364,08±0,35 Ед/л. Уровень значимости различий показателей активности ЛДГ в крови контрольной группы и группы с COVID-19 третьей степени поражения легких составил p≤0,05.
Концентрация ТГ в крови больных отклонялась от нормальных значений в 2 раза в терминальной стадии развития заболевания (КТ-4), достигая значений в 1,53±0,13 ммоль/л, в то время как в сыворотке крови больных с меньшими повреждениями легочной ткани уровень ТГ не изменялся и не выходил за пределы референсных значений (p≤0,05). При сравнении значений показателя в крови групп контроля и экспериментальных групп значимости различий не было обнаружено, а уровень ТГ в крови больных контрольной группы исследования оставался в пределах референсных значений. Значительные отклонения концентрации ионов калия от референсных значений наблюдались в сыворотке крови больных, входивших в группу КТ-4 (3,1±0,22 ммоль/л). В ходе исследования была обнаружена значимость различий между концентрацией в сыворотке крови контрольной группы и группе больных c терминальной стадией развития COVID-19 (4,11±0,88 ммоль/л, p≤0,05) [9].
Таким образом, было определено, что диагностической значимостью обладали показатели концентраций ферритина, ИЛ-6, лактата, альбумина и активности ЛДГ в сыворотке крови больных COVID-19. Уровень этих показателей достоверно отличался от биохимической картины крови у больных с пневмонией, вызванной вирусом группы А, что делает их прогностическими биомаркерами тяжелой формы заболевания.
В ходе исследования были отмечены некоторые тенденции в проявлении биохимических маркеров воспаления в крови при новой коронавирусной инфекции на разных этапах развития заболевания, что позволило определить манифестный характер биомаркеров в кровеносном русле и выявить последовательности включения адаптационных процессов в регулирование нарастающего патологического воспалительного процесса (от первой стадии к четвертой), вызванного COVID-19 (рис. 1, 2). При развитии первой степени поражения легких при COVID-19 в первую очередь отмечалось повышение уровня СРБ в крови больных, что свидетельствует о возможном начале включения метаболических процессов, характерных для острой фазы воспаления, как включение иммунного ответа на проникший антиген.
|
|
|
|
Рис. 1. Изменения концентрации биохимических показателей сыворотки крови на разных стадиях развития новой коронавирусной инфекции (* p≤0,01, ** p≤0,05 – уровень значимости различий концентрации биохимических показателей между экспериментальными группами) |
Рис. 2. Изменения концентрации лактата, калия и ТГ в сыворотке крови на разных стадиях развития новой коронавирусной инфекции (* p≤0,01, ** p≤0,05 – уровень значимости различий концентрации биохимических показателей между экспериментальными группами) |
Изменение уровня данного биохимического показателя, предположительно, оказывало сильное провоспалительное неспецифическое действие, что вызывало увеличение проницаемости стенок сосудов [10] и рост уровня другого белка острой фазы – ферритина, значительное повышение концентрации которого было отмечено также в начале развивающегося воспалительного процесса. Уровень ИЛ-6 в крови оставался в пределах референсных значений и на данном этапе не изменялся, как и уровень альбумина. В развитии первой стадии воспалительного процесса, на наш взгляд, большинство клеток легочной ткани оставались вне зоны поражения вирусом и продолжали свое нормальное функционирование, обеспечивая организм достаточным количеством веществ, в том числе кислородом. Буферные системы крови справлялись с возникшими патологическим процессами, не подключая еще адаптационные процессы, связанные с формированием гипоксии, способные «переключить» организм с окислительного фосфорилирования на путь гликолиза с образованием излишка кислых продуктов обмена веществ. Потому активность ЛДГ и концентрация лактата не превышали норму.
Концентрации ТГ и калия в крови оставались в пределах допустимых значений.
При увеличении площади поражения легочной ткани возбудителем SARS-COV-2 и при формировании второй степени поражения легких (КТ-2), мы предполагаем, происходило включение в механизм воспаления других биохимических процессов, препятствующих развитию воспалительной реакции, что отмечено в росте концентрации биомаркеров. Биохимическая картина отражала постепенное снижение концентрации СРБ в 2 раза, при том что концентрация ферритина в крови больных COVID-19 продолжала повышаться, это, возможно, повлияло на миграцию макрофагов и лейкоцитов в место очага воспаления с последующим началом активной выработки ИЛ-6 [11]. Такие изменения в концентрациях белков острой фазы, как мы предполагаем, связаны с местом локализации ферритина, который, в отличие от СРБ (синтез происходит в основном в гепатоцитах), синтезируется в организме как в печени – месте выработки всех основных белков воспаления, так и в легких, в связи с чем при повреждении альвеол атакой ИЛ-6 его концентрация повышалась дополнительно, помимо стимуляции его выработки интерлейкинами (повышение в 3 раза) [12; 13]. Рост уровня белков острой фазы в крови стал причиной увеличения синтетических процессов, протекающих в клетке с использованием аминокислот, в связи с чем в организме наблюдалась диспротеинемия. На фоне увеличения концентрации белков воспаления происходит снижение синтеза транспортных белков, что проявляется в исследовании в первую очередь в виде постепенного понижения концентрации альбумина в крови.
Очевидно, процессы, происходящие в клетках, приводят к более значительным повреждениям легочной паренхимы, где мишенью оказывались как пораженные вирусом, так и здоровые клетки. Гибель клеток и выделение продуктов их обмена веществ в кровь влекли понижение уровня альбумина и повышение уровней лактата и активности ЛДГ, что говорит о нарушении белкового обмена, а также развитии ацидотических процессов. Для компенсации формирующегося ацидоза в организме включаются буферные системы гомеостаза, приводящие к незначительному временному повышению уровня калия в крови, покидающего клетку взамен на ионы водорода, и, таким образом, возвращающего pH в пределы нормы. Уровни ТГ и калия в сыворотке крови больных, так же как и в первую стадию заболевания, оставались в пределах референсных значений.
Третья стадия поражения легочной ткани при COVID-19 характеризовалась ухудшением состояния больного, что проявляется в резком и манифестном поведении концентраций исследуемых биохимических показателей, кроме концентрации СРБ. На наш взгляд, такая картина была связана с тем, что СРБ являлся неспецифическим белком и манифестировал только в начале заболевания, как белок первой иммунной неспецифической реакции. Рост уровня ИЛ-6 продолжался, что, возможно, стало причиной начала «цитокинового шторма», запускающего глубокие механизмы повреждения, и свидетельствовал о начале процесса аутоагрессии организма. Повышение концентрации ИЛ-6 в крови в свою очередь провоцировало еще более значительное повышение концентрации ферритина, уровень которого в крови достигал манифестации, возрастая в 4 раза в сравнении с началом заболевания и в 20-40 раз по сравнению с нижней границей референсных значений. «Цитокиновый шторм» приводил к массовой гибели клеток, что, возможно, становилось одной из причин высвобождения ферритина из внутриклеточного пространства, в первую очередь пневмоцитов и гепатоцитов, что отразилось на содержании белка острой фазы в крови. Кроме этого, продолжался активный синтез ферритина, стимулирующего выработку ИЛ-6, в качестве белка острой фазы. Клетка находилась в условиях избытка белков острой фазы, что отмечалось в продолжении снижения концентрации альбумина в крови вплоть до уровня нижней границы референсных значений.
Причиной повышения активности ЛДГ в 2-2,5 раза и концентрации лактата в 2-3 раза становилась сформированная гипоксемия на фоне замедления в митохондриях энергетических процессов и переключения организма на субстратное фосфорилирование, продукты которого при гибели клеток оказывались в кровеносном русле. Развивающееся метаболическое нарушение провоцировало дальнейшее понижение уровня ТГ.
Динамика изменения концентрации калия в сыворотке крови больных группы КТ-3 демонстрировала тенденцию к повышению.
Четвертая стадия поражения легких (КТ-4), свидетельствующая о тяжелом течении новой коронавирусной инфекции [14], характеризовалась манифестами концентрации ферритина (более чем в 10 раз), ИЛ-6 (более чем в 150 раз). На фоне повышения концентраций большинства биохимических показателей было отмечено понижение уровня альбумина. Возможно, такое поведение связано с нарушением синтетических процессов в клетках и использованием необходимых для альбумина аминокислот для синтеза белков воспаления. Уровень альбумина в крови оказался почти в два раза ниже нормы. Происходило повышение активности ЛДГ (в среднем в 10 раз) и концентрации лактата (в 3,6 раза), которые становятся предикторами необратимого адаптационного процесса.
Избыточное цитотоксическое действие ИЛ-6 влияло на нарушения энергетических процессов в клетках, так как воспалительный процесс – это обычно энергетически затратный процесс [15]. Вероятнее всего, происходило истощение запасов глюкозы, в связи с чем мы можем наблюдать отклонения в концентрации ТГ. Возможно, для компенсации гипогликемии в организме задействовались процессы глюконеогенеза, и в качестве источника энергии на более поздних этапах повреждения легких использовались ТГ, чья концентрация медленно снижалась в крови больных. Понижение концентрации ионов калия в сыворотке крови больных новой коронавирусной инфекцией, вероятно, было связано с его истощением в результате использования в процессах свертывания крови, значительно активирующихся при COVID-19, а также в процессах, компенсирующих возникающий в организме ацидоз. Концентрация калия в крови больных в терминальной стадии заболевания достигала 3,10±0,22 ммоль/л, что почти в 2 раза ниже референсных значений.
Заключение
Таким образом, диагностической значимостью обладают тесты на определение концентраций ферритина, ИЛ-6, лактата, альбумина и активности ЛДГ в сыворотке крови больных COVID-19.
Первая степень поражения легких при COVID-19 характеризуется подъемом концентрации СРБ и ферритина; при развитии второй стадии поражения легких продолжается повышение концентраций в крови ферритина, активности ЛДГ и понижение концентрации СРБ, манифестация в концентрации ИЛ-6; третья степень повреждения легочной ткани сопровождается манифестацией в повышении концентрации ферритина, ЛДГ, манифестацией в понижении концентрации калия и продолжением повышения концентрации лактата; для четвертой степени поражения легочной ткани характерны манифестный характер в повышении концентрации ферритина, ИЛ-6, лактата, повышение активности ЛДГ и понижение концентрации калия.