В настоящее время наблюдается растущий интерес к растительным полисахаридам. Природные полисахариды используются в качестве отхаркивающих, обволакивающих, противовоспалительных, противотуберкулезных, ранозаживляющих средств. Они способны стимулировать процессы гемопоэза и иммунопоэза [1; 2]. Полисахариды снижают уровень липидов и холестерина в сосудистом русле, так как образуют комплексы с белками и липопротеидами. Пектины растений, например винограда, смородины и черники, понижают фибринолитическую активность крови. Выраженный кровоостанавливающий эффект проявляют полисахариды бурых водорослей – альгинаты [3].
Растения лопуха большого обладают богатым химическим составом и широкой сырьевой базой. Корень лопуха большого широко используется в России как мочегонное и потогонное средство, применяется при подагре, при лечении гастрита, язвы желудка и двенадцатиперстной кишки [4]. Известно, что водные, водно-спиртовые экстракты и настойки из различных частей растения лопуха большого проявляют выраженное противовоспалительное, противотуберкулезное действие [5-7].
В настоящее время в различных научных лабораториях исследуется химический состав полисахаридов разных классов, выделенных из зеленых частей растений лопуха большого и лопуха войлочного [8-10]. Для данных растений разработаны методики экстракции, очистки полисахаридов различных классов, установлен химический состав и некоторые элементы строения, изучены физико-химические свойства этих полисахаридов [11; 12].
В некоторых работах определено противовоспалительное и антиоксидантное действия полисахаридов лопуха большого [13].
Нашими исследованиями впервые установлена стимуляция процессов гемопоэза под влиянием введения полисахарида листьев лопуха большого здоровым животным и отсутствие токсичности, аллергенности, пирогенности этого полисахарида [14].
В связи с этим представляет интерес изучение антианемического действия полисахарида лопуха большого.
Целью исследования являлось изучение воздействия полисахарида, полученного из листьев лопуха большого, на состав крови и гемопоэз у животных с моделью свинцово-уксуснокислой анемии.
Материалы и методы исследования
Полисахарид из листьев растения лопуха большого был получен по методике, представленной в работах [12; 14].
Во всех исследованиях крысам вводили 5%-ный водный раствор полисахарида.
В эксперименте использовали 60 крыс породы Wistar обоего пола. В помещении, где содержали животных, поддерживали температуру воздуха 22 ± 2 °C, влажность 60 ± 5% и 12-часовой режим (свет с 8:00 до 20:00). Животные были обеспечены водой и кормом ad libitum. Модель свинцово-уксусной анемии вызывали введением подопытным животным в течение 5 суток 10%-ного водного раствoра свинца ацетата, перорально в дозе 60 мг/кг массы тела.
Как только экспериментальная модель анемии была создана, экспериментальным животным ежедневно вводили 5%-ный водный раствор полисахарида листьев лопуха большого в дозе 0,1 г/кг массы. Крысы контрольной группы получали равный объем дистиллированной воды. Животные опытной и контрольной групп содержались в одинаковых условиях вивария.
Животных из эксперимента выводили по стандартизированной методике. У крыс контрольной и опытной групп на 3, 5, 7, 10, 15 и 20-е сутки опыта брали кровь, обе бедренные кости, тимус и селезенка. Определяли количество эритроцитов, лимфоцитов, лейкоцитов, тромбоцитов и моноцитов в приготовленных мазках крови. Анализ крови выполняли на гематологических анализаторах фирмы SYSMEX (оптическим методом). Количество гемоглобина определяли по стандартной методике. Клеточный состав крови определяли также и на гемоанализаторе.
Количество эритробластических островков (ЭО) и их численность различных классов зрелости определяли по методике Захарова и А.Г.Рассохина [15]. Бедренную кость животных очищали от мышц и соединительных тканей, удаляли эпифиз и диафиз. С помощью шприца с 1 мл среды выделения (60 мл среды 199,33 мл 10% раствора альбумина человека, 1 мл гепарина с активностью 5000 Ед/мл, 10000 Ед пенициллина) выдавливали костный мозг, вымывали из канала бедренной кости в пробирку Видаля. Повторяли процедуру со второй бедренной костью.
Столбики костного мозга суспендировали в питательную среду, окрашенную 0,1 мл 0,1% раствором нейтрального красного в изотоническом растворе.
Полученную взвесь фильтровали через ячейки металлической сетки размером 0,1х0,1мм и помещали для осаждения на 15 минут во влажную чашку Петри.
Эритробластические островки подсчитывали в камере Горяева, в 225 больших квадратах при увеличении 200 на микроскопе фирмы OLIMPUS,
Абсолютное количество островков подсчитывали по формуле:
,
где А – число эритробластических островков костного мозга (тыс./бедро); n – число островков в 225 больших квадратах камеры Горяева;
3 – разбавление исходной смеси; 2000 – общий объем полученной взвеси клеток костного мозга; 0,9 – объем камеры Горяева; 2 – количество бедренных костей.
С помощью программы StatSoftStatistica 13.0 обрабатывали полученные результаты. Для подтверждения гипотезы о нормальности распределения применяли критерий Шапиро–Уилка. Для сравнения двух групп использовалиt-критерий Стьюдента с поправкой Уэлча. Для снижения эффекта множественных сравнений использовали поправку Бенжамини–Хохберга. Различия считали значимыми приp< 0,05.
По критерию Шапиро-Уилка определяли тип распределения полученных в эксперименте данных, которые обрабатывали тестом ANOVA. По критерию Ньюмена-Кейсла определяли межгрупповые различия. В таблице данные представлены в виде среднего арифметического ± стандартное отклонение.
Все проведенные исследования на крысах линии Вистар выполнены исходя из положений Европейской конвенции по защите и использованию экспериментальных животных; на основании Приказа № 708н от 23.08.2010 «Правила лабораторной практики», а также Приказа № 742 от 13 ноября 1984 г. «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных».
Результаты исследования и их обсуждение
У крыс с моделью анемии общее количество эритробластических островков на 14,6±0,12% (p<0,05) меньше показателя здорового контроля. При этом число островков 3-го класса зрелости в 3 раза меньше, а островков 1-го класса на 16,3±0,18% (p<0,05) ниже, чем в контроле.
Полисахарид листьев лопуха большого при введении в организм животных с анемией стимулирует увеличение количества эритробластических островков и достигает максимума на 5-е сутки эксперимента, превосходя здоровый контроль на 47,53±0,23% (p<0,05). При этом численность эритробластических островков I класса на 28,52%±0,12% (p<0,05), II класса в 3,52 раза больше, чем в контроле.
На 7-й день введения полисахарида лопуха большого общее количество эритробластических островков в костном мозге крыс остается таким же - 1252,0±0,05 (p<0,05), а количество островков I класса снижается и только на 9,87±0,21% (p<0,05) превышает контроль, а число островков II класса возрастает и в 7,5 раз превосходит значения здорового контроля. Численность островков III класса снижается до 81,8±0,32% (p<0,05) от уровня контроля. На десятые сутки эксперимента общее количество эритробластических островков снижается и на 22,8±0,23% превосходит контроль, но при этом количество островков I класса такое же, как и в контроле 803*103±0,15 (p<0,05), II класса в 5,1 раза больше контрольных значений, а III класса на 27,23±0,35% (p<0,05) меньше, чем в контроле.
На 15-е сутки опыта общее число эритробластических островков у животных, получавших полисахарид лопуха большого, только на 3,91±0,12% (p<0,05) превышает контрольные значения, и при этом количество островков I и III классов на уровне значений контроля, а II класса на 48,5±0,27% (p<0,05) превосходит значения контроля.
У животных с анемией и без введения полисахарида общее количество островков костного мозга на 5-е сутки опыта на 18,85±0,18% (p<0,05) больше, чем в контроле, при этом островков I класса на 6,8±0,16% больше, чем в контроле, II класса в 4,5 раза больше, чем в контроле, а III класса на 50,0±0,35% меньше, чем в контроле (p<0,05). На 7-й день опыта общее количество островков у крыс с анемией и без полисахарида незначительно возрастает и на 21,89±0,22% (p<0,05) превышает контрольные показатели. Количество островков I класса зрелости остается практически неизменным (на 5,12±0,35% больше по сравнению с контролем (p<0,05)), численность островков II класса возрастает в 6,1 раза, а III класса на 37,5±21% меньше, чем в контроле (p<0,05). На десятые сутки эксперимента общее количество островков заметно возрастает и на 33,85±0,36% превышает контроль. При этом количество островков I класса такое же, как в контроле, II класса в 9 раз превышает контрольные показатели, а III класса на 18,75±0,12% выше по сравнению с контрольными значениями. На 15-й день опыта общее количество островков костного мозга у животных с анемией и не получавших полисахарид на 5,8±0,32% превышает контроль. Количество островков I и III классов практически не отличается от контрольных показателей, а островков II класса на 6,2±0,42% больше, чем в контроле. Все данные статистически достоверны и представлены в таблице.
Изменение общего количества ЭО под действием растительных полисахаридов у животных с анемией
|
|
Класс Э.О. |
|||
|
I класс |
II класс |
III класс |
||
|
Контроль
|
810*103± 0.12 |
46*103± 0.17 |
22*103± 0.17 |
|
|
Анемия |
670*103± 0.13 |
56*103± 0.23 |
5*103± 0.19 |
|
|
3-и сутки |
Контроль |
800*103± 0.22 |
48*103± 0.10 |
17*103± 0.18 |
|
Анемия (n = 6) |
733*103± 0.20 |
106*103± 0.16 |
7*103± 0.24 |
|
|
Анемия+ПСЛ (n = 6) |
1016*103± 0.18 |
157*103± 0.31 |
20*103± 0.16 |
|
|
5-е сутки |
Контроль |
805*103± 0.11 |
35*103± 0.16 |
15*103± 0.17 |
|
Анемия (n = 6) |
864*103± 0.22 |
162*103± 0.27 |
8*103± 0.25 |
|
|
Анемия+ПСЛ (n = 6) |
1041*103 ± 0.32 |
194*103± 0.12 |
22*103± 0.18 |
|
|
7-е сутки |
Контроль |
800*103± 0.19 |
30*103± 0.14 |
17*103± 0.22 |
|
Анемия (n = 6) |
840*103± 0.15 |
230*103± 0.16 |
10*103± 0.20 |
|
|
Анемия+ПСЛ (n = 6)
|
890*103± 0.17 |
344*103± 0.22 |
18*103± 0.25 |
|
|
10-е сутки |
Контроль |
800*103± 0.09 |
41*103± 0.21 |
17*103± 0.25 |
|
Анемия (n = 6) |
803*103± 0.18 |
380*103± 0.26 |
19*103± 0.26 |
|
|
Анемия+ПСЛ (n = 6) |
812*103± 0.15 |
235*103± 0.18 |
16*103± 0.17 |
|
|
15-е сутки |
Контроль |
803*103± 0.11 |
48*103± 0.17 |
17*103± 0.15 |
|
Анемия (n = 6) |
812*103± 0.22 |
54*103± 0.18 |
21*103± 0.11 |
|
|
Анемия+ПСЛ (n = 6) |
805*103± 0.13 |
71*103± 0.22 |
16*103± 0.14 |
|
p<0,05
Под влиянием введения крысам линии Вистар уксусно-кислого свинца у животных развивается состояние анемии, и при этом количество эритроцитов уменьшается до 4,8±0,06*10 г/л (р<0,05), что на 26,3% меньше нормального уровня. Уровень гемоглобина снижается до 93,5±0,69 (р<0,05), что на 23,7% меньше показателей здорового животного.
Полисахарид активирует процессы эритропоэза, увеличивая количество эритроцитов на 3-и сутки опыта до 5,31±0,07 (p<0,05), а гемоглобина до 116,9±0,23 (p<0,05). Данные статистически достоверны и представлены на рисунках 1 и 2 соответственно.
Рис. 1. Изменение количества эритроцитов (1012/л) у животных с анемией при введении препарата полисахарида лопуха большого
У крыс с моделью анемии и без введения полисахарида количество эритроцитов составляет 5,13±0,10 (p<0,05), а уровень гемоглобина 106,2±0,61 (p<0,05). На 5-е сутки введения полисахарида листьев лопуха большого количество эритроцитов увеличивается до 5,91±0,08 (p<0,05), а гемоглобина – до 121,42±1 (p<0,05). У животных с анемией и без введения полисахарида листьев лопуха большого в крови наблюдается слабое увеличение числа эритроцитов до 5,24±0,06 (p<0,05) и гемоглобина до 110,6±0,81 (p<0,05). На 7-й день введения полисахарида листьев лопуха большого стимуляция гемопоэза вызывает рост показателей красной крови почти до уровня нормы: количества эритроцитов на 5,04±0,06%, а уровень гемоглобина на 3,21±0,12% (p<0,05) меньше, чем в контроле (p<0,05). У крыс с моделью анемии и без введения полисахарида листьев лопуха большого количество эритроцитов меньше на 14,86±0,21% (p<0,05), а гемоглобина – на 12,38±0,11% (p<0,05), чем в норме.
На 10-й день эксперимента количество эритроцитов и гемоглобина составляет 6,41±0,15 (p<0,05) и 125,11±0,21 (p<0,05), что соответствует нормальным значениям. У крыс с моделью анемии и не получавших полисахарид листьев лопуха большого количество эритроцитов составляет 5,82±0,35, а гемоглобина 121,12±0,28 (p<0,05), что на 5-7% ниже нормы (p<0,01). На 15-й день эксперимента у животных с моделью свинцово-уксуснокислой анемии и с введением полисахарида количество эритроцитов и гемоглобина доходит до верхней границы нормы. Количество эритроцитов у животных с анемией и без воздействия полисахарида составляет 6,22±0,25 (p<0,05), а уровень гемоглобина 122,32±0,41 (p<0,05), что соответствует уровню нижней границы нормы.
Рис. 2. Изменение количества уровня гемоглобина (г/л) у животных с анемией при введении препарата полисахарида лопуха большого
Заметно уменьшается количество клеток белой крови у животных с анемией. Так, численность лейкоцитов составляет 57,09±0,15% (р<0,05), лимфоцитов 85,71±0,24% (р<0,05), а моноцитов 29,33±0,31% (р<0,05) от уровня значений здорового контроля. Все данные статистически достоверны и представлены на рисунках 3 и 4.
Рис. 3. Изменение количества лимфоцитов (%) у животных с анемией при введении полисахарида листьев лопуха большого
Под влиянием введения полисахарида количество лейкоцитов на 7-е сутки эксперимента возрастает до уровня здорового контроля, а на десятый день опыта уменьшается и на 9,76±0,25% меньше показателей здорового контроля. У крыс с анемией и без полисахарида количества лейкоцитов на 7-е сутки опыта возрастает, превышая показатели здорового контроля на 57,46±0,12% (р<0,05), а на десятый день опыта снижается до уровня контроля.
Количество лимфоцитов под влиянием введения полисахарида крысам с анемией возрастает максимально на 10-й день опыта, превосходя здоровый контроль на 21,89±0,21% (р<0,05). У животных с моделью анемии, вызванной уксуснокислым свинцом, и без введения полисахарида лопуха большого количество лимфоцитов находится на уровне нижней границы показателей здорового контроля и составляет 95,7±0,18% (р<0,05).
Рис. 4. Изменение количества лейкоцитов (109/л) у животных с анемией при введении полисахарида листьев лопуха большого
Возможно, введение полисахарида листьев лопуха большого животным с анемией активирует процессы эритропоэза, а также и иммунопоэза, так как при этом возрастает не только количество лимфоцитов в крови, но и моноцитов, численность которых возрастает максимально на 7-й день опыта, превосходя здоровый контроль на 17,3±0,12% (р<0,05). У крыс с анемией количество моноцитов возрастает на 10-е сутки эксперимента и составляет 88,0±0,22% (р<0,05) от показателя здорового контроля.
По предварительным данным, под влиянием полисахарида листьев лопуха большого у животных с анемией в селезенке увеличивается количество лимфоидных фолликулов, клеточная плотность в области периартериальной муфты (Т-зона) и на внешней границе Т-зоны белой пульпы, на пятый и особенно на седьмой день эксперимента. В структуре тимуса заметно возрастает клеточность мозговой и особенно корковой зоны органа на 7-й день введения полисахарида. Все это свидетельствует об активации процессов пролиферации и дифференциации лимфоцитов, что приводит к увеличению численности этих клеток в крови на 10-й день опыта.
Полисахарид, выделенный из листьев лопуха большого, стимулирует процессы эритропоэза и иммунопоэза.
Выводы
1. Количество эритробластических островков у животных с анемией при введении полисахарида листьев лопуха большого достигает максимальных значений на 5-й день эксперимента, превышая норму на 47,53%.
2. В структуре костного мозга крыс с анемией полисахарид лопуха большого активирует процессы пролиферации и дифференциации, максимально увеличивая численность эритробластических островков I класса на 28,52% на 5-й день опыта, а количество эритробластических островков II класса в 7,5 раз на 7-е сутки эксперимента по сравнению со здоровым контролем.
3. Введение полисахарида листьев лопуха большого активирует эритропоэз на 7-е сутки опыта, увеличивая в крови крыс с моделью свинцово-уксусной анемии количество эритроцитов и уровень гемоглобина. На 10-й день эксперимента под действием полисахарида эти показатели достигают верхней границы нормы.
4. Полисахарид лопуха большого увеличивает в крови животных с анемией на 7-10-е сутки опыта количество моноцитов – на 17,93%, а лимфоцитов – на 21,89% по сравнению со здоровым контролем.
5. У крыс с моделью свинцовой уксуснокислой анемии и без введения полисахарида на 15-е сутки опыта показатели красной крови восстанавливаются, достигая нижней границы нормы.