В последние годы внимание исследователей привлекает терапия злокачественных опухолей путем воздействия на иммунную систему организма [1-3]. В этом плане некоторые координационные соединения 3d-металлов рассматриваются в качестве перспективных кандидатов для коррекции показателей иммунной системы [4-6]. Предыдущие исследования показали, что соединения 3d-металлов (Mn, Fе, Со, Сu и Zn) с глюконовой кислотой (MGl) оказывают корригирующее действие на окислительный и иммунный гомеостаз [7, 8], а композиция глюконатов 3d-металлов ингибирует развитие индуцированной миеломы [9]. Предположительно противоопухолевое действие MGl связано с их иммунотропными свойствами, однако механизм действия не изучен и связь между изменениями показателей иммунной системы и прогрессирования опухоли не исследована.
Известно, что важным показателем естественного иммунитета является функциональное состояние фагоцитирующих клеток [10]. Поскольку в элиминации неопластических клеток значительная роль отводится нейтрофилам, исследование их поглотительной и метаболической активности на фоне опухолевого процесса с помощью реакции с нитросиним тетразолием (НСТ-тест), отражающей функциональную активность фагоцитов [11], является важной задачей для решения вопроса о связи показателей иммунной системы и прогрессирования опухоли.
Цель исследования: оценить влияние глюконатов марганца, меди и цинка на фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови мышей BALB/c с индуцированной миеломой Sр 2/0 Аg14 и взаимосвязь с прогрессированием опухоли.
Материал и методы исследования
Эксперимент проводили на линейных белых мышах BALB/c, самцах массой 25–28 г. (n=120), полученных из питомника лабораторных животных филиала ФГУП НПО Микроген МЗ РФ (Республика Башкортостан, Чишминский район, село Горный). Животных содержали в условиях вивария ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России с соблюдением Международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1997 г.), а также правил лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ З 51000.3-96 и 51000.4-96). Моделирование индуцированной миеломы проводили путем однократного внутрибрюшинного введения клеток мышиной миеломы Sр 2/0 Аg14 в количестве 106 клеток на мышь.
Глюконаты марганца (MnGl), меди (СuGl) и цинка (ZnGl) были синтезированы и охарактеризованы в лаборатории физико-химических методов анализа ОСП ФГБНУ Уфимского института химии УфИЦ РАН по описанным методикам [5]. Соединения металлов вводили в концентрации 10-2 моль/л с помощью желудочного зонда по 0,18–0,2 мл раствора на мышь, в зависимости от веса животного. Мыши контрольных групп получали дистиллированную воду в том же объеме. Курс терапии составлял 3 недели, забор крови осуществляли на 23-й день после начала эксперимента в пробирки, обработанные антикоагулянтом ЭДТА. Мышей, по 10 особей из каждой группы, декапитировали под эфирным наркозом в соответствии с Положением о гуманном отношении к животным (МЗ РФ от 19 июня 2003 г. № 267). Остальных животных наблюдали в течение 3 месяцев. Фагоцитарную активность нейтрофилов определяли по показателям поглотительной активности: фагоцитарное число (ФЧ), фагоцитарный индекс (ФИ), интегральный фагоцитарный индекс (ИФИ) – и показателям метаболической активности, которую оценивали по НСТ-тесту: спонтанному (сп НСТ) и стимулированному латексом (ст НСТ), а также по спонтанному и стимулированному среднему цитохимическому коэффициенту (сп СЦК, ст СЦК) и индексу стимуляции (ИС). ФЧ определяли с помощью иммерсионной микроскопии по среднему числу частиц латекса в клетке в мазках крови, приготовленных путем смешивания в соотношении 3:1 с латексом (ПанЭко, РФ), фиксирования смесью Никифорова и окрашивания 1%-ным метиленовым синим, ФИ – по проценту нейтрофилов, участвующих в фагоцитозе, ИФИ – по формуле: ИФИ=(ФИ×ФЧ)/100 (%). НСТ определяли по восстановлению поглощенного нейтрофилами растворимого красителя нитросинего тетразолия в нерастворимые глыбки диформазана, которые визуально учитывали также путем микроскопирования. СЦК вычисляли по формуле: СЦК=(3С+2В+А)/100, где А – процент клеток с интенсивностью 1, В – с интенсивностью 2, умноженный на коэффициент 2, С – с интенсивностью 3, умноженный на 3 [12]. ИС рассчитывали по формуле: ст СЦК / сп СЦК.
Прогрессирование миеломы оценивали по приросту массы тела в граммах и объему асцита в миллилитрах. Медиану продолжительности жизни в сутках определяли по средней величине, полученной по наблюдениям за 3 месяца.
Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы «Statistica 10,0». Определяли следующие статистические показатели: среднее значение (М); стандартное отклонение (σ); медиану (Ме), квартили 25%–75% (Q1–Q3), критерий Манна–Уитни (p). Взаимосвязь между показателями фагоцитарной активности нейтрофилов и прогрессирования индуцированной миеломы выявляли с помощью расчета коэффициентов ранговой корреляции Спирмена (rs). Отличия считали статистически значимыми при p<0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
Нейтрофилы являются ключевыми иммунными клетками при воспалительных процессах. Они одни из первых привлекаются к поврежденной ткани для устранения патогена и модулирования воспаления с помощью фагоцитоза и секреции ферментов [13]. При онкопатологии могут наблюдаться высокие уровни нейтрофилов крови и/или высокое соотношение между нейтрофилами и лимфоцитами, что является неблагоприятным прогнозом [14]. В то же время при неопластических процессах функциональная активность нейтрофилов может быть снижена [15]. В согласии с этими данными результаты наших исследований (табл. 1) показали, что в крови мышей с индуцированной миеломой без лечения (группа № 2) наблюдалось снижение поглотительной активности нейтрофилов по сравнению с контрольной группой интактных животных (группа № 1). Показатели поглотительной активности снижались следующим образом: ФЧ – на 51,2%, ФИ – на 51,5%, ИФИ – на 63,2%. Показатели метаболической активности снижались также значительно: сп НСТ и ст НСТ – на 41,7% и 61,6%; сп СЦК и ст СЦК – на 42,9% и 66,7%; ИС – на 28% (р<0,05).
В группе сравнения, в которой мыши получали циклофосфамид (группа № 3), относительно группы № 1 происходило снижение показателей как поглотительной активности нейтрофилов: ФЧ – на 43,9%, ФИ – на 57,6%, ИФИ – на 73,7%, так и метаболической активности: сп НСТ и ст НСТ – на 38,9% и 45,1%; сп СЦК и ст СЦК – на 28,6% и 52,4%; ИС – на 24% (р<0,05). По сравнению с группой № 2 поглотительная активность тоже несколько снижалась, особенно ИФИ – на 10,5%, а метаболическая активность, напротив, повышалась: ст НСТ – на 16,5%, сп СЦК и ст СЦК – на 14,3% (р<0,05).
После применения глюконатов 3d-металлов наблюдалось увеличение показателей поглотительной активности. Так, после терапии глюконатом цинка по сравнению с группой № 2 ФЧ увеличивался на 34,1%, ИФИ – на 15,8% (р<0,05).
Таблица 1
Влияние глюконатов 3d-металлов на поглотительную и метаболическую активность нейтрофилов периферической крови мышей BALB/c с индуцированной миеломой Sр 2/0 Аg14 (ИМ) в сравнении с цитостатиком циклофосфамидом (ЦФ)
|
Статистический показатель |
Группы мышей |
|||||
|
1 (n=10) |
2 (n=10) |
3 (n=10) |
4 (n=10) |
5 (n=10) |
6 (n=10) |
|
|
Интактные- контроль |
ИМ без лечения |
ИМ+ ЦФ |
ИМ+ MnGl |
ИМ+ CuGl |
ИМ+ ZnGl |
|
|
Фагоцитарное число (ФЧ) |
||||||
|
Ме (Q1–Q3) р-знач. |
4,1 (3,5–4,3)
|
2,0 (1,7–2,2) р1-2<0,001
|
2,3 (1,9–2,4) p1-3<0,001 р2-3=0,06 p3-4=0,03 p3-5=0,01 p3-6<0,001 |
2,6 (2,4–2,9) p1-4<0,001 p2-4=0,001 p3-4=0,03 p4-5=0,44 p4-6<0,001
|
2,6 (2,4–2,9) p1-5<0,001 p2-5=0,001 p3-5=0,01 p4-5=0,44 p5-6<0,001 |
3,4 (3,2–3,6) p1-6=0,08 p2-6<0,001 p3-6<0,001 p4-6<0,001 p5-6<0,001 |
|
Фагоцитарный индекс (ФИ), % |
||||||
|
Ме (Q1–Q3) р-знач |
49,5 (43,8–54,0)
|
24,0 (22,1–27,7) р1-2<0,001
|
21,0 (19,0–23,2) p1-3<0,001 p2-3=0,11 p3-4=0,002 p3-5=0,005 p3-6=0,007 |
27,2 (25,8–31,3) p1-4<0,001 p2-4=0,08 p3-4=0,002 p4-5=0,36 p4-6=0,45
|
26,7 (24,1–29,5) p1-5<0,001 p2-5=0,11 p3-5=0,005 p4-5=0,36 p5-6=0,47 |
26,5 (23,3–30,3) p1-6<0,001 p2-6=0,10 p3-6=0,007 p4-6=0,45 p5-6=0,47 |
|
Интегральный фагоцитирующий индекс (ИФИ), % |
||||||
|
Ме (Q1–Q3) р-знач |
1,9 (1,75–2,12)
|
0,7 (0,62–0,75) р1-2<0,001
|
0,5 (0,40–0,54) p1-3<0,001 р2-3<0,001 p3-4<0,001 p3-5=0,001 p3-6<0,001 |
0,7 (0,67–0,82) p1-4<0,001 p2-4=0,26 p3-4<0,001 p4-5=0,34 p4-6=0,002 |
0,7 (0,63–0,76) p1-5<0,001 p2-5=0,27 p3-5=0,001 p4-5=0,34 p5-6=0,002 |
0,97 (0,88–1,03) p1-6=<0,001 p2-6=0,001 p3-6<0,001 p4-6=0,002 p5-6=0,002 |
|
Спонтанный НСТ-тест (сп НСТ), % |
||||||
|
Ме (Q1–Q3) р-знач |
7,2 (6,4–8)
|
4,2 (3,3–4,4) р1-2<0,001
|
4,4 (4,1–5,1) p1-3<0,001 р2-3=0,11 p3-4<0,001 p3-5=0,26 p3-6=0,008
|
7,2 (6,52–7,56) p1-4=0,41 p2-4<0,001 p3-4<0,001 p4-5=0,002 p4-6=0,03 |
5,0 (4,5–5,6) p1-5=0,001 p2-5=0,005 p3-5=0,26 p4-5=0,002 p5-6=0,02 |
6,0 (5,52–6,74) p1-6=0,05 p2-6=0,002 p3-6=0,008 p4-6=0,03 p5-6=0,02 |
|
Стимулированный НСТ-тест (ст НСТ), % |
||||||
|
Ме (Q1–Q3) р-знач
|
52,1 (48,4–56)
|
20,0 (18,4–22,04) р1-2<0,001
|
28,6 (22,8–30) p1-3<0,001 р2-3=0,001. p3-4<0,001 p3-5<0,001 p3-6<0,001
|
48,1 (42,6–52) p1-4=0,11 p2-4<0,001 p3-4<0,001 p4-5=0,004 p4-6=0,13 |
36,6 (32,03–40) p1-5=0,001 p2-5<0,001 p3-5<0,001 p4-5=0,004 p5-6=0,06 |
42,6 (37,2–47) p1-6=0,03 p2-6<0,001 p3-6<0,001 p4-6=0,13 p5-6=0,06 |
|
Средний цитохимический коэффициент в спонтанном тесте (сп СЦК), у.е. |
||||||
|
Ме (Q1–Q3) р-знач |
0,07 (0,07–0,09)
|
0,04 (0,04–0,04) р1-2<0,001
|
0,05 (0,04–0,05) p1-3=0,002 р2-3=0,05 p3-4<0,001 p3-5=0,02 p3-6=0,001
|
0,08 (0,08–0,09) p1-4=0,24 p2-4<0,001 p3-4<0,001 p4-5=0,006 p4-6=0,01 |
0,06 (0,05–0,08) p1-5=0,12 p2-5=0,002 p3-5=0,02 p4-5=0,006 p5-6=0,15 |
0,07 (0,06–0,07) p1-6=0,36 p2-6=0,001 p3-6=0,001 p4-6=0,01 p5-6=0,15 |
|
Средний цитохимический коэффициент в стимулированном тесте (ст СЦК), у.е. |
||||||
|
Ме (Q1–Q3) р-знач |
0,21 (0,20–0,22)
|
0,07 (0,05–0,08) р1-2<0,001
|
0,10 (0,08–0,10) p1-3<0,001 р2-3=0,01 p3-4<0,001 p3-5<0,001 p3-6<0,001 |
0,20 (0,17–0,22) p1-4=0,32 p2-4<0,001 p3-4<0,001 p4-5=0,006 p4-6=0,21 |
0,15 (0,12–0,17) p1-5<0,001 p2-5<0,001 p3-5<0,001 p4-5=0,006 p5-6=0,34 |
0,17 (0,16–0,18) p1-6=0,009 p2-6<0,001 p3-6<0,001 p4-6=0,21 p5-6=0,34 |
|
Индекс стимуляции (ИС), у.е. |
||||||
|
Ме (Q1–Q3) р-знач |
2,5 (2,3–2,7)
|
1,8 (1,6–1,8) р1-2=0,001
|
1,9 (1,7–2,2) p1-3=0,007 р2-3=0,08 p3-4=0,03 p3-5=0,07 p3-6=0,02 |
2,4 (2,2–2,7) p1-4=0,58 p2-4=0,001 p3-4=0,03 p4-5=0,59 p4-6=0,84 |
2,3 (2,0–2,5) p1-5=0,24 p2-5=0,002 p3-5=0,07 p4-5=0,59 p5-6=0,58 |
2,5 (2,2–2,6) p1-6=0,70 p2-6<0,001 p3-6=0,02 p4-6=0,84 p5-6=0,58 |
По сравнению с группой № 3 показатель ФЧ возрастал на 26,8%, ФИ – на 11,1%, ИФИ – на 26,3% (р<0,05). Метаболическая активность возрастала после применения всех глюконатов, особенно после терапии глюконатом марганца, достигая уровня интактных животных: по сравнению с группой № 2 на 41,7% (сп НСТ), 53,9% (ст НСТ), 57,2% (сп СЦК), 61,9% (ст СЦК), 24% (ИС) (р<0,05); по сравнению с группой № 3 – 38,9% (сп НСТ), 37,4% (ст НСТ), 42,9% (сп СЦК), 47,6% (ст СЦК) и 20% (ИС) (р<0,05).
Показатели прогрессирования миеломы по группам составили по приросту массы тела (г): № 2 – (13,2±2,2); № 3 – (9,4±1,6)2,4,6; № 4 – (6,5±1,0)2,3,5,6; № 5 – (9,3±1,4)2,4; № 6 – (8,4±1,4)2,3,4. По объему асцита (мл): № 2 – (6,8±1,0); № 3 – (4,8±0,8)2,4,6; № 4 – (3,4±0,6)2,3,5,6; № 5 – (4,7±0,8)2,4; № 6 – (4,3±0,6)2,3,4.
Примечание. 2-6 означает достоверность различий между группами № 2–6 (р<0,05).
Значения медианы продолжительности жизни по группам имели следующий вид: № 2 – 24,3; № 3 – 61,6; № 4 – 72,4; № 5 – 56,1; № 6 – 68,6.
Для предположения возможного механизма действия глюконатов 3d-металлов на индуцированную мышиную миелому Sp2/0 Ag14 у мышей BALB/c был проведен корреляционный анализ Спирмена между показателями фагоцитарной активности нейтрофилов и прогрессирования опухоли. Корреляционная зависимость выявлена между снижением показателя стимулированного НСТ-теста и объемом асцита (rs=0,64, p=0,05) в группе мышей с индуцированной миеломой без лечения, что свидетельствует об усилении злокачественного роста клеток при снижении активации НАДФН-оксидазных реакций, сопровождающихся образованием активных форм кислорода. Проведение курса терапии с применением препарата сравнения циклофосфамида выявило также корреляционную связь между снижением показателей ИФИ и приростом массы тела (rs=0,68, p=0,03), что указывает на зависимость роста индуцированной миеломы от поглотительной активности нейтрофилов.
После курса терапии глюконатом марганца тесная корреляционная связь обнаружена между увеличением показателя стимулированного НСТ-теста и снижением обоих показателей прогрессирования индуцированной миеломы (rs=0,65, p=0,04; rs=0,61, p=0,05). После терапии глюконатами меди и цинка корреляционная связь обнаружена между увеличением ФЧ и снижением объема асцита (rs=0,67, p=0,03 и rs=0,68, p=0,03 соответственно), а после введения глюконата меди – между увеличением ФИ и снижением прироста массы тела (rs=0,67, p=0,03), что доказывает наличие зависимости между этими факторами. Также умеренная корреляционная связь выявлена между увеличением показателя ст СЦК, отображающего активность энергетических ресурсов ферментных систем нейтрофилов, и снижением прироста массы тела после терапии глюконатом цинка (rs=0,64; p=0,05).
В качестве одного из возможных механизмов противоопухолевого действия соединений 3d-металлов рассматривается их способность инициировать апоптоз [2, 16, 17]. Полученные нами результаты показали, что под действием глюконатов марганца, меди и цинка происходит увеличение фагоцитарной активности нейтрофилов. Корреляция между этим фактором и снижением прогрессирования индуцированной миеломы позволяет сделать предположение о механизме противоопухолевого действия исследуемых соединений металлов путем инициации апоптоза.
Заключение
По результатам оценки воздействия глюконатов 3d-металлов на поглотительную и метаболическую активность нейтрофилов у мышей с индуцированной миеломой наибольшая эффективность обнаружена для глюконата марганца, далее следуют глюконат цинка и глюконат меди.
Увеличение метаболической активности нейтрофилов, сопровождающееся повышенным образованием активных форм кислорода, коррелирует со снижением показателей прогрессирования индуцированной миеломы Sp2/0 Ag14 у мышей BALB/c, что указывает на возможный механизм противоопухолевого действия глюконатов 3d-металлов путем инициации апоптоза.
Синтез и физико-химическое исследование глюконатов 3d-металлов выполнены с использованием оборудования Центра коллективного пользования «Химия» Уфимского института химии Уфимского федерального исследовательского центра Российской академии наук и Регионального центра коллективного пользования «Агидель» Уфимского федерального исследовательского центра Российской академии наук.
Работа выполнена в рамках государственного задания Министерства науки и высшего образования № 122031400246-1.