Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) характеризуются хроническим воспалением желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), которым страдают более 6 млн человек во всем мире [1, 2]. Болезнь Крона (БК) – это сегментарное, асимметричное и трансмуральное воспаление, которое может поражать весь ЖКТ, но чаще наблюдается в подвздошной и толстой кишках. ЯК связан с воспалением слизистой оболочки от прямой кишки до проксимального отдела толстой кишки [3–5]. Лечение ВЗК имеет первостепенное значение для качества жизни пациентов, поскольку заболевание оказывает большое влияние на физические, психологические и социальные аспекты жизни. В этиологии заболевания сочетаются несколько факторов: генетическая предрасположенность, дефекты врожденного и приобретенного иммунитета, неблагоприятные изменения кишечной микрофлоры, а также факторы окружающей среды. Под воздействием факторов риска происходят активация Th1/Th2, гиперэкспрессия провоспалительных цитокинов. В результате происходит формирование лимфоплазмацитарной инфильтрации с деструкцией стенки толстой кишки с характерными макроскопическими изменениями и развитием клинической картины. В 30% случаев отмечается непереносимость препаратов базисной терапии (5-аминосалициловой кислоты, глюкокортикостероидов), поэтому по-прежнему актуальны разработка и внедрение в лечебную практику эффективных стратегий по терапии ВЗК [6]. Ранее в эксперименте нами продемонстрирован положительный эффект локального применения при ВЗК куркумина, витамина D3, эритропоэтина в составе оригинальных лекарственных средств [7–9]. К методам патогенетической терапии можно отнести физические методы, которые не являются альтернативой фармакологическим методам, но которые могут дополнять, потенцировать действие лекарственных средств. В этом отношении перспективным направлением в медицине представляется применение медицинского озона за счет его противовоспалительного, антиоксидантного, иммуномодулирующего действия.
Цель исследования. Оценить противовоспалительный эффект озона при внутрибрюшинном применении при экспериментальном колите.
Материалы и методы исследования. Эксперимент одобрен этическим комитетом федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (Воровского 64, Челябинск, Россия), протокол № 1 от 22.05.2020 г. Животных содержали согласно стандартам в условиях вивария. Обращение с животными соответствовало правилам гуманного отношения и выведения из опыта животных, определенным Директивой 2010/63/EU Европейского Парламента и Совета Европейского Союза от 22.09.2010 г. по охране животных для научных целей. Материалом для исследования послужили 72 крысы линии Wistar массой 220±10 г, которых с помощью генератора случайных чисел разделили на 4 группы: I (n=9) — интактный контроль, II (n=21) — животные с оксазолон-индуцированным колитом (ОИК), III (n=21) — животные с ОИК на фоне внутрибрюшинной инсуффляции ОКС, IV (n=21) — животные с ОИК, получающие ректальные суппозитории с 5-аминосалициловой кислотой (5-АСК). Применяли внутривенную анестезию золетилом в дозировке 0,02 г/кг (МНН: тилетамина гидрохлорид) (Virbac Sante Animale; Фpaнция). ОИК моделировали с помощью двух этапов применения 3%-ного спиртового раствора оксазолона (4-этоксиметилен-2-фенил-2-оксазолин-5-он). На первом этапе сенсибилизировали кожу путем нанесения 675 мкл/кг спиртового раствора оксазолона на область между лопаток, во втором этапе ректально вводили 675 мкл/кг в толстую кишку на глубину 7 см [10]. Озонокислородную смесь (ОКС) получали на аппарате «УОТА-60-01» («Медозон», Россия). Верификацию ОИК проводили по оценке морфологии участка повреждения в толстой кишке. Суппозитории с 50 мг 5-АСК в каждом суппозитории для крыс готовили на основе препарата «Салофальк» (МНН: Месалазин, «Doctor Falk Pharma GmbH», Германия). Животных выводили из эксперимента на 2-е, 4-е и 6-е сутки от индукции ОИК. Определяли диаметр язвенного дефекта, плотность сосудистой сети, оценивали повреждения толстой кишки по индексу повреждения тканей (tissue damage index, TDI) от 0 до 6 с учетом лейкоцитарной фильтрации, плотности сосудов и толщины стенки кишечника, площади повреждения, утраты бокаловидных клеток [11]. Общее количество лейкоцитов в крови исследовали на гематологическом анализаторе, откалиброванном для крови крыс, «ВС-2800Vet» («Mindray», Китай). Концентрацию в сыворотке С-реактивного белка (С-РБ) определяли с помощью специфической для крыс тест-системы («ElisaKit», Китай). Полученные данные обрабатывали с помощью программы IBM SPSS Statistics v. 19. Характеристика выборок представлена в виде «Me (Q1; Q3)», где Мe – медиана, Q1 и Q3 – значение нижнего и верхнего квартиля соответственно. Проверку статистических гипотез в группах проводили с использованием непараметрических критериев (Манна–Уитни, Вальда–Вольфовитца, Краскелла–Уоллиса). Статистические различия между группами с учетом поправки Бонферрони считали значимыми при p≤0,02.
Результаты исследования и их обсуждение. Отражением развития ОИК является морфологическая картина толстой кишки: на 2-е сутки в очаге повреждения отмечены язвенные дефекты в слизистой оболочке, подслизистый слой разрыхлен, резко утолщен за счет выраженного отека, увеличена плотности сосудистой сети; TDI варьировал от 2 до 3 ед. На 4-е и 6-е сутки увеличение TDI происходило преимущественно за счет дальнейшего увеличения размера язвенного дефекта, толщины стенки кишечника без значимого увеличения плотности сосудистой сети; TDI варьировал от 3 до 4 ед. и в динамике ОИК на 4-е и 6-е сутки был больше (р<0,01), чем на 2-е сутки (табл. 1). Изменения в очаге повреждения, связанные с воспалительным процессом, нашли отражение в показателях ответа острой фазы в крови (табл. 2). На 2-е сутки ОИК в крови увеличивалось количество лейкоцитов за счет палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофилов, лимфоцитов, моноцитов. На 2-е, 4-е и 6-е сутки ОИК наблюдалось увеличение количество лейкоцитов в крови за счет сегментоядерных нейтрофилов, лимфоцитов, моноцитов (только на 6-е сутки). Наряду с этим на 2-е, 4-е и 6-е сутки повышалась концентрация С-РБ в сыворотке. В динамике ОИК на 4-е и 6-е сутки в крови общее количество лейкоцитов и сегментоядерных нейтрофилов меньше (р<0,01), чем на 2-е сутки, количество эозинофилов и концентрация С-РБ в сыворотке больше (р<0,01), чем на 2-е сутки.
Таким образом, при ОИК на 2-е, 4-е и 6-е сутки увеличиваются индекс повреждения ткани толстой кишки TDI, количество лейкоцитов в крови преимущественно за счет лимфоцитов, С-РБ в сыворотке; максимальная выраженность морфологических признаков повреждения в толстой кишке и концентрации С-РБ в сыворотке – на 4-е и 6-е сутки, максимальные количество в крови нейтрофилов, моноцитов – на 2-е сутки. Морфологическая картина поражения толстой кишки, показатели ответа острой фазы в крови при ОИК соответствуют изменениям при ВЗК у человека, что способствует применению оксазолоновой модели колита для изучения патогенеза и апробации эффективности применения новых терапевтических стратегий при ВЗК [12].
Применение ОКС при ОИК в очаге повреждения на 2-е, 4-е, 6-е сутки приводило к сокращению диаметра язвенного дефекта, увеличению площади распределения сосудов, снижению интегрального показателя повреждения ткани TDI (табл. 1). Полагаем, что увеличение площади сосудов отражает пролиферацию неоангиогенеза и ускорение репаративных реакций в области повреждения.
Ранее нами показано, что внутрибрюшинные инсуффляции озона при ОИК усиливают окислительную деструкцию белков и липидов в очаге повреждения толстой кишки на 2-е сутки, что обусловлено прямыми окислительными свойствами озона, его способностью выступать в качестве прооксиданта [13]. На начальных этапах воспаления озон активирует факторы транскрипции, такие как HIF-1α и NF-kβ, повышает продукцию провоспалительных цитокинов IL-1β, IL-6 и TNF-α [14]. Наряду с этим обнаружены системные изменения в крови при ОИК в условиях внутрибрюшинного применения озона (табл. 2). Количество лейкоцитов в крови снижалось на 2-е, 4-е и 6-е сутки преимущественно за счет лимфоцитов, палочкоядерных нейтрофилов на 2-е сутки, эозинофилов – на 4-е сутки и моноцитов – на 6-е сутки; на 4-е сутки увеличивалось количество сегментоядерных нейтрофилов в крови. Общее количество лейкоцитов и нейтрофилов на 2-е, 4-е и 6-е сутки, количество лимфоцитов и моноцитов на 2-е сутки значимо отличалось от аналогичных показателей контрольной группы. Концентрация в сыворотке С-РБ снижалась на 4-е и 6-е сутки, но не достигла уровня интактных животных на 6-е сутки ОИК.
Таким образом, при экспериментальном ОИК в условиях внутрибрюшинного применения озона на 4-е и 6-е сутки наблюдения снижается выраженность морфологических признаков повреждения толстой кишки по показателю TDI, снижается концентрация С-РБ в сыворотке; на 2-е, 4-е, 6-е сутки снижается в крови общее количество лейкоцитов и количество лимфоцитов. Полагают, что противовоспалительные эффекты озона реализуются за счет активации транскрипционного фактора Nrf2, Nrf2-опосредованной Keap1-зависимой активации синтеза СОД, каталазы, глутатионпероксидазы, глутатионредуктазы, глутатион-S-трансферазы, гемоксигеназы, НАДФН-хиноноксидоредуктазы-1 и иных ферментов антиоксидантной защиты [15]. Кроме этого, Nrf2 подавляет активность NF-kβ и продукцию провоспалительных цитокинов за счет прямых белок-белковых взаимодействий при умеренном окислительном стрессе под воздействием озона. Данный эффект озона потенцируется ингибицией NLRP3 и ограничением синтеза IL-1β и IL-18.
На фоне применения 5-АСК при ОИК отмечены противовоспалительные свойства: на 2-е, 4-е, 6-е сутки – снижение количества лейкоцитов в крови за счет нейтрофилов и моноцитов, концентрации в сыворотке С-РБ (табл. 2). Данные факты нашли отражение в морфологической картине: снижении TDI на 4-е и 6-е сутки наблюдения, уменьшении размера язвенного поражения на 2-е, 4-е, 6-е сутки, увеличении площади распределения сосудов в очаге повреждения на 4-е и 6-е сутки (табл. 1).
Таблица 1
Морфометрические данные в очаге повреждения толстого кишечника при ОИК (Ме (Q1; Q3))
|
Показатели |
Группа I Интактные (n=9) |
Группа II ОИК |
Группа III ОИК + ОКС ВБ |
Группа IV ОИК + 5-АСК |
||||||
|
2-е сутки (n=7) |
4-е сутки (n=7) |
6-е сутки (n=7) |
2-е сутки (n=7) |
4-е сутки (n=7) |
6-е сутки (n=7) |
2-е сутки (n=7) |
4-е сутки (n=7) |
6-е сутки (n=7) |
||
|
Площадь распределения сосудов, мкм2 |
12250,10 (10300,00;14400,00) |
29700,10 (24800,00; 32300,00) * |
15650,10 (14500,00; 17800,00) * |
17600,10 (17400,00; 19500,00) * |
25450,10 (19600,00;26700,00) * |
24450,10 (22200,00;28800,00) * # |
18450,10 (15500,00;23400,00) * |
28950,10 (28500,00; 30100,00) * |
26200,10 (23700,00; 28300,00) * # |
28800,10 (19200,00; 30800,00) * # |
|
Диаметр язвенного дефекта, мкм |
0 |
629,97 (397,97; 726,95) * |
795,98 (691,97; 864,89) * |
792,97 (439,97; 876,78) * |
323,32 (274,97; 349,97) * # |
200,97 (187,97; 207,97) * # |
197,79 (190,97; 243,97) * # |
338,89 (184,33; 463,61) * # |
439,97 (381,25; 495,95) * # $ |
184,21 (149,35; 194,97) * # |
|
TDI, у.е. |
0 |
3,00 (2,00;3,00) * |
4,00 (3,00;4,00) * |
4,00 (4,00;5,00) * |
3,00 (3,00;4,00) * |
2,00 (2,00;3,00) * # |
2,00 (2,00;3,00) * # |
2,00 (2,00;3,00) * |
3,00 (2,00;3,00) * # |
1,00 (1,00;2,00) * # |
|
Примечание: *– статистически значимые (p<0,01) различия с группой интактных животных; # – с группой II; $ – с группой III. ОИК – оксазолон-индуцированный колит. 5-АСК – 5-аминосалициловая кислота, TDI – индекс повреждения ткани. |
||||||||||
Таблица 2
Влияние применения ОКС или 5-АСК на количественный состав лейкоцитов и СРБ в крови при ОИК (Ме (Q1; Q3))
|
Показатели |
Группа I Интактные (n=9) |
Группа II ОИК |
Группа III ОИК + ОКС ВБ |
Группа IV ОИК + 5-АСК |
||||||
|
2-е сутки (n=7) |
4-е сутки (n=7) |
6-е сутки (n=7) |
2-е сутки (n=7) |
4-е сутки (n=7) |
6-е сутки (n=7) |
2-е сутки (n=7) |
4-е сутки (n=7) |
6-е сутки (n=7) |
||
|
Лейкоциты, • 109/л |
5,23 (4,24;6,42) |
16,76 (14,04;19,28) * |
15,07 (13,87;15,66) * |
14,63 (13,36;15,41) * |
14,92 (11,84; 18,28) * |
6,97 (6,06; 7,91) € |
4,98 (4,42; 5,81) # € €€ |
8,37 (6,92;10,91) * # $ |
4,82 (4,31;6,31) # $ ¥ |
4,34 (3,71;4,87) # ¥ |
|
Нейтрофилы, • 109/л
|
1,57 (1,34;1,71) |
5,56 (2,63;6,63) * |
2,78 (1,99;3,54) * |
3,54 (1,93;5,14) * |
8,98 (7,68; 10,69) * # |
3,85 (3,25; 4,47) * € |
1,72 (1,21; 2,32) € €€ |
4,63 (2,52;8,19) * $ |
1,74 (1,16;1,82) # $ ¥ |
1,53 (1,12;2,14) # ¥ |
|
Палочкоядерные нейтрофилы, • 109/л |
0,03 (0;0,05) |
0,33 (0,21;0,38) * |
0,01 (0;0,01) |
0,09 (1,93;5,14) |
0,06 (0,01; 0,12) # |
0,02 (0,02; 0,03) |
0,04 (0,03; 0,05) # |
0,08 (0;0,11) # |
0,03 (0;0,03) $ |
0,04 (0;0,07) |
|
Сегментоядерные нейтрофилы, • 109/л |
1,56 (1,34;1,65) |
5,26 (2,41;6,14) * |
2,77 (1,99;3,54) * |
3,44 (1,61;5,14) * |
8,92 (7,56; 10,51) * # |
3,87 (3,25; 4,47) * € |
1,75 (1,36; 2,29) € €€ |
4,58 (2,52;8,17) * $ |
1,72 (1,16;1,82) # $ ¥ |
1,52 (1,12;2,07) ¥ |
|
Эозинофилы, • 109/л
|
0,12 (0;0,12) |
0,03 (0;0,05) |
0,10 (0,05;0,12) |
0,23 (0,06;0,29) |
0,35 (0,12; 0,38) # |
0,13 (0,04; 0,23) |
0,04 (0; 0,13) € |
0,04 (0;0,11) $ |
0,11 (0,06;0,17) |
0,09 (0;0,17) |
|
Лимфоциты, • 109/л |
3,26 (2,32;4,48) |
10,47 (10,93;12,58) * |
11,83 (11,41;13,19) * |
10,28 (6,31;12,71) * |
4,92 (3,21; 6,21) # |
2,63 (2,21;3,05) € |
3,04 (2,11; 4,21) # |
3,39 (2,57;4,41) # |
2,72 (2,01;0,81) # |
2,48 (2,27;3,02) # |
|
Моноциты, • 109/л |
0,28 (0,23;0,32) |
0,67 (0,47;0,81) * |
0,33 (0,14;0,41) |
0,56 (0,36;0,75) * |
0,57 (0,51; 0,61) * |
0,36 (0,31; 0,41) € |
0,17 (0,10; 0,21) * € €€ |
0,29 (0,21;0,36) # $ |
0,24 (0,15;0,25) |
0,23 (0,17;0,25) # |
|
CРБ, г/л |
95,07 (81,54;110,95) |
186,42 (154,88;189,26)* |
239,48 (192,62;267,26)* |
245,06 (136,27;271,71)* |
188,24 (145,49;198,68)* |
141,66 (128,65;200,78)* # |
112,77 (99,64;125,79)# € |
124,88 (110,46;149,54)# $ |
98,93 (93,61;104,35)# $ ¥ |
78,22 (72,21;85,17)# $ ¥ ¥¥ |
|
Примечание: *– статистически значимые (p<0,05) различия с группой интактных животных; # – с группой II; $ – с группой III; € – с группой III на 2-е сутки, €€ – с группой 3-и на 4-е сутки, ¥ – с группой IV на 2-е сутки, ¥¥ – с группой IV на 4-е сутки. ОИК – оксазолон-индуцированный колит, 5-АСК – 5-аминосалициловая кислота, ОКС – озонокислородная смесь, ВБ – внутрибрюшинно, СРБ – с-реактивный белок. |
||||||||||
Противовоспалительный эффект при ОИК в условиях применения внутрибрюшинных инсуффляций ОКС по сравнению с применением ректальных суппозиториев с 5-АСК оказывает менее выраженный эффект на снижение выраженности морфологических признаков повреждения в толстой кишке, за исключением уменьшения площади распределения сосудов; системные признаки воспаления, включая количество в крови нейтрофилов, моноцитов, лимфоцитов, концентрацию С-РБ, уменьшаются более выраженно при применении 5-АСК, а не озона.
Выводы
1. При ОИК в динамике 6-суточного наблюдения максимальная выраженность морфологических признаков повреждения в толстой кишке и концентрации С-РБ в сыворотке отмечается на 4-е и 6-е сутки и количество в крови нейтрофилов, моноцитов – на 2-е сутки.
2. При ОИК внутрибрюшинные инсуффляции озона в дозе 0,05 мг/кг ежедневно приводят на 4-е и 6-е сутки наблюдения к снижению морфологических признаков повреждения толстой кишки по показателю TDI, снижению концентрации С-РБ в сыворотке; на 2-е, 4-е, 6-е сутки – к снижению количества в крови лейкоцитов преимущественно за счет лимфоцитов.
3. Эффекты при ОИК внутрибрюшинных инсуффляций озона по сравнению с эффектами применения каждые 12 ч ректальных суппозиториев с 50 мг 5-АСК менее выражены в отношении морфологической картины по данным TDI, снижения концентрации С-РБ в сыворотке и количества лейкоцитов в крови на 2-е, 4-е, 6-е сутки; более выражены в отношении площади распределения сосудов на 2-е и 6-е сутки.