Сахарный диабет 2-го типа (СД2) – это полигенное мультифакторное заболевание, характеризующееся хронической гипергликемией, которая является результатом нарушения секреции, действия инсулина или обоих этих факторов [1]. В течение жизни человек подвергается воздействию различных ксенобиотиков, одним из биологических эффектов которых является генотоксическое действие, приводящее к возникновению онкогенных мутаций. Мутагенные и промутагенные вещества могут быть детоксицированы соответствующими ферментами биотрансформации ксенобиотиков, однако в случае изменения энзиматической активности последних «обезвреживание» мутагенов происходит замедленными темпами или с повышенной активностью, что является проблемой применения медикаментозной терапии, поскольку лекарственные средства также относятся к ксенобиотикам. Биохимическими и генетическими аспектами персонализации диагностики и лечения различных заболеваний ученые начали задаваться не так давно. Биологическое разнообразие реакций биотрaнсформaции ксенобиотиков определяет различную эффективность фармакотерапии, с одной стороны, и тяжесть побочных эффектов от фармакотерапии – с другой [2]. Не вызывает в настоящее время сомнений, что на формирование СД2 оказывают влияние не только генетические факторы, но и неблагоприятное влияние окружающей среды и образ жизни, который ведет данный человек. Признаки неправильного образа жизни часто проявляются у пациента такими фенотипическими особенностями, как ожирение, артериальная гипертензия, дислипидемия, остеопороз и др. [3-5]. Генетическую составляющую также можно проследить, выяснив у пациента анамнез заболевания. Скрининг мутаций генов может обеспечить дополнительные параметры для профилактических мероприятий. В практическом здравоохранении проводится скрининг на мутации в генах, причастных к развитию рака щитовидной железы, существует молекулярно-генетическая панель наиболее часто встречающихся генов, ведущих к низкорослости и к различным обменным заболеваниям в детской популяции. Но, учитывая, что СД 2-го типа – это мультифакторное заболевание и его патогенез не изучен до конца, точно понять, мутация каких генов приводит к развитию этого заболевания, сложно [6]. В стандартах оказания помощи пациентам с сахарным диабетом 2-го типа № 1581н молекулярно-генетическое исследование не представлено ввиду его дороговизны. Средняя стоимость исследования полиморфизмов генов варьирует от 2000 до 5000 руб. за один ген. Однако, с нашей точки зрения, выявление генов, приводящих к более тяжелому течению СД 2-го типа и его осложнениям, позволит врачам профилактировать то или иное осложнение заранее, тем самым повышая качество и продолжительность жизни пациентов, а также снижая экономическое бремя на систему здравоохранения. Исследование генетических полиморфизмов направлено не только на раннее выявление предрасположенности к СД 2-го типа, но и на изучение эффективности использования того или иного сахароснижающего препарата [7]. Это в своем исходе должно указать путь к персонализированному подходу к пациенту и повышению выявленного процента больных, достигших целевого уровня гликированного гемоглобина, либо времени нахождения в целевом диапазоне (в случае использования непрерывного мониторинга гликемии). Найти оптимальное средство для оптимизации лекарственной терапии, учитывая генотип пациента, обеспечить максимальный эффект с минимальными побочными эффектами – это основная цель развивающегося направления медицинской науки – фармакологической генетики [8]. Пациенты с СД2 – это коморбидные пациенты. Помимо сахарного диабета, они часто страдают ишемической болезнью сердца, ожирением, неалкогольной жировой болезнью печени и т.д. Соответственно, помимо терапии сахарного диабета, они получают лечение сопутствующих заболеваний. И число употребляемых ими препаратов нередко достигает 6–8 в сутки. Если имеет место полиморфизм генов биотрaнсформaции ксенобиотиков, то это, теоретически, может влиять не только на эффективность данных препаратов, но и на токсическое влияние их «необезвреженных» метаболитов на организм. Кроме того, необходимо обратить внимание и на осложнения гипергликемии, а именно на микроангиопатии и полинейропатию, которые часто также требуют медикаментозного лечения. Вопрос о том, от чего зависит выраженность тех или иных осложнений у пациентов, до сих пор не разрешен до конца. С нашей точки зрения, одним из наиболее серьезных осложнений является диабетическая нефропатия (ДНП). Из-за своего бессимптомного течения она часто не диагностируется вовремя, а на терминальных стадиях приводит к развитию тяжелейших последствий, таких как анемия, нарушение фосфорно-кальциевого обмена, артериальная гипертензия, уремическая интоксикация и диализ [9]. Одним из объединяющих патогенетических механизмов сахарного диабета является активация системной воспалительной реакции с образованием избытка продуктов окислительного стресса и формированием эндотелиального дисбаланса. Система генов GSTM кодирует серию ферментов глутатион-S-трансфераз (Г-S-Т), относящихся к мю-классу, обладающих способностью катализировать присоединение трипептида глутатиона к электрофильному центру разнообразных соединений, что приводит к потере токсичности и образованию более гидрофильных продуктов [10]. Рассмотрение полиморфных вариантов генов системы биотрaнсформaции ксенобиотиков и антиоксидантной защиты в сочетании с последующей оценкой оксидативного статуса каждого наблюдаемого пациента, а также в сочетании с клинической картиной и данными лабораторных исследований поможет подтвердить гипотезу в отношении влияния того или иного полиморфизма генов биотрaнсформaции ксенобиотиков на состояние баланса в системе про-/антиоксиданты и тяжесть течения ДНП.
Цель исследования – изучить роль полиморфных вариантов гена фермента 2-й фазы системы биотрaнсформaции ксенобиотиков – глутатин-S-трансферазы (ген GSTP1(Ile105Val)) – в развитии ДНП у пациентов с СД 2-го типа.
Материалы и методы исследования
Исследование проводилось на базе кафедры «Биология с курсом медицинской генетики» и кафедры «Эндокринология ФПК и ППС» ФГБОУ ВО «Кубанский государственный медицинский университет МЗ КК». Набор пациентов происходил на базе Краевой клинической больницы скорой медицинской помощи г. Краснодара в период с сентября по декабрь 2021 г. В исследование включались лица русской национальности, коренные жители Краснодарского края. Исследование подобного рода на территории Краснодарского края проводилось впервые.
Изучались две популяции: пациенты с СД 2-го типа и пациенты без СД 2-го типа. В основную группу были включены 50 пациентов с СД 2-го типа в возрасте 45–70 лет, без тяжелых сопутствующих патологий, с длительностью сахарного диабета до 5 лет, уровнем гликированного гемоглобина не более 10% и уровнем СКФ не менее 45 мл/мин/1,73м2. Критерии исключения: СД 1-го типа / другие типы сахарного диабета; наличие тяжелых осложнений СД (таких как протеинурия, почечная недостаточность, макрососудистые осложнения); наличие тяжелой сопутствующей соматической патологии; пациенты с первичным поражением почек (инфекционным, сосудистым, токсическим, иммуновоспалительным, опухолевым); возраст моложе 45 и старше 70 лет; уровень гликированного гемоглобина более 10%; длительность СД 2-го типа более 5 лет и уровень СКФ менее 45 мл/мин/1,73м2.
Контрольная группа была сформирована из 20 добровольцев, сопоставимых по возрасту, полу и этнической принадлежности, не являющихся родственниками пациентов основной группы и не имевших в анамнезе СД 2-го типа, тяжелые поражения почек, тяжелую сопутствующую соматическую патологию.
Генотипирование при помощи ПЦР позволило в дальнейшем разделить пациентов основной и контрольной групп на подгруппы в зависимости от определяемого полиморфизма гена GSTP-1 (I105V): гомозиготы с нулевым (делеционным) генотипом (гомозиготы по аллелю 2 – 0/0) гомозиготы с нормальным генотипом (гомозиготы по аллелю 1 – +/+) , гетерозиготы с генотипом (+/0) по определенным генам и генным локусам.
Протокол исследования был рассмотрен и одобрен локальным этическим комитетом ФГБОУ КубГМУ МЗ КК. Перед началом любых процедур после разъяснения цели работы, применяемых методов и способов использования полученных данных каждый пациент подписал информированное добровольное согласие на участие в настоящем исследовании. У всех пациентов – участников исследования проводились тщательный сбор анамнеза и жалоб, антропометрическое обследование. Для проведения клинико-лабораторных исследований использовались образцы сыворотки крови, полученные при центрифугировании пробирок с цельной венозной кровью со скоростью 3 тыс. об/мин в течение 5 минут при комнатной температуре. Наряду с физикальным обследованием у больных оценивались уровни глюкозы натощак и постпрандиальной гликемии, а также проводились общий анализ крови, биохимический анализ крови, общий анализ мочи с определением белка в моче, определение гликированного гемоглобина. Оценка микроальбуминурии осуществлялась в разовой порции мочи после полной стабилизации гликемического профиля (в контрольном общем анализе мочи перед выпиской). Оценка показателей оксидативного статуса производилась по показателям крови пациента, которые определялись непосредственно перед выпиской после полной нормализации гликемии и исчезновения ацетонурии.
Состояние баланса в системе про-/антиоксидантов организма наблюдаемых пациентов и контрольной группы оценивалось по активности ферментов системы антиоксидантной защиты (АОЗ) и уровню основного продукта свободнорадикального окисления (СРО) – малонового диальдегида (МДА) в крови, активность каталазы (КАТ) – по методике М.А. Королюк и соавт.; активность глутатионтрансферазы и уровень МДА – по методике И.Д. Стальной, Т.Г. Гаришвили, активность супероксиддисмутазы (СОД) оценивали по методике Т.В. Сирота; (Г-S-Т) – по методике, описанной А.И. Карпищенко [11].
В работе было проведено сравнительное изучение показателей скорости клубочковой фильтрации (СКФ), микроальбуминурии, потребности в инсулине и основных показателей системы про-/антиоксидантов у пациентов с ДНП с индивидуальными особенностями полиморфных вариантов изучаемых генных локусов.
Достоверность различий в распределении частот генотипов между группами больных и здоровых лиц оценили по тесту χ2, по методу сопряженных таблиц (четырехпольная таблица). Числовые распределения показателей системы антиоксидантной защиты и перекисного окисления липидов проверялись на соответствие нормальному распределению с применением критерия Шапиро–Уилка. В ходе исследования числовые распределения показателей соответствовали нормальному закону. Количественные показатели в биохимических характеристиках пациентов (показатели активности ферментов ФБК и СРО) оценивались по критерию Стьюдента. Статистически значимыми считали различия при p менее 0,05. Расчеты выполнены с помощью программы STATISTICA 6.1 Stat-Soft Inc, США.
Результаты исследования и их обсуждение
У пациентов с СД 2-го типа (пациентов основной группы) процент выявленных гетерозиготных носителей (+/0) генa GSTP-1 (I105V) – 16%, а гомозиготных по аллелю 1 (+/+) – 76%, гомозиготных по аллелю 2 (0/0) – 8%, в отличие от контрольной группы, в которой процент гетерозиготных носителей (+/0) составил 65%, а гомозиготных носителей (+/+) – 35%, а носители гетерозигот по аллелю 2 (0/0) не были выявлены. При рассмотрении результатов основной группы по компонентам ДНП значимых различий между гетерозиготными носителями (+/0) и гомозиготными носителями по аллелю 1 (+/+) в уровне СКФ, микроальбуминурии выявлено не было. Так, средний уровень СКФ в подгруппах гомозиготного и гетерозиготного полиморфизма изучаемого гена в основной группе составил 64 мл/мин/1,73 м2, средний уровень микроальбуминурии – 0,18 г/л, суточная потребность в инсулине – 26 ед/сут. А вот показатели пациентов – носителей мутантной гомозиготы по аллелю 2 (0/0) – были значительно хуже. Так, уровень СКФ в этой подгруппе пациентов основной группы составил 48 мл/мин/1,73 м2, уровень альбуминурии в разовой порции мочи составил 0,9 г/л, суточная потребность в инсулине – 17,6 Ед/сут.
Наиболее выраженные изменения показателей ферментов АОЗ основной группы (ферменты КАТ и СОД) были в группе гомозиготных носителей по аллелю 1. Однако это не коррелировало со снижением функции почек. Показатели активности ферментов АОЗ в подгруппе носителей мутантной гомозиготы (0/0) были значительно выше, чем в аналогичной подгруппе контрольной группы, однако значимо не отличались от показателей подгрупп гетерозиготных (+/0) и гомозиготных носителей по аллелю 1 (+/+) контрольной группы. А вот уровень СРО – МДА в подгруппе носителей мутантной гетерозиготы (+/0) был значительно выше (100,5 мкМоль/л), чем в других подгруппах основной группы пациентов (таблица).
Показатели системы антиоксидантной защиты и перекисного окисления липидов у лиц с различными полиморфными вариантами гена GSTP-1 (Ile105Val)
Ile105Val |
МДА (мкМоль/л) |
КАТ (нмоль H2O2/мг Hb) |
Г-S-T (мкмоль/мин/мг белка) |
СОД (усл.ед.) |
Основная группа генотип (+/0) n-14 |
24,6±2,78* р<0,001 |
40,3±4,17* р<0,05 |
30,0±3,2* р<0,05 |
81,8±4,6* р<0,05 |
Основная группа генотип (+/+) n-31 |
34,90±2,5** р<0,001 |
40,7±1,6** р<0,001 |
42,2±2,3** р<0,001 |
89,1±2,2** р<0,001 |
Основная группа генотип (0/0) n-5 |
100,5±4,7*** р<0,05 |
42,1±8,3*** р<0,001 |
29,6±6,9*** р<0,05 |
89,2±8,4*** р<0,05 |
Контрольная группа генотип (+/0) n-13 |
6,4±0,5 |
30,5±1,6 |
28,1±1,33 |
75,0±3,07 |
Контрольная группа генотип (+/+) n-7 |
5,8±0,49 |
33,08±3,4 |
32,5±3,15 |
73,8±3,08 |
Примечание: МДА – малоновый диальдегид; СОД – супероксиддисмутаза; КАТ – каталаза; Г-S-Т – глутатионтрансфераза. * – в сравнении с гетерозиготными носителями исследуемого гена в контрольной группе; ** – в сравнении с гомозиготными носителями исследуемого гена в контрольной группе; *** – в сравнении с показателями основной группы генотипов (+/0) и (+/+).
В таблице приведены данные зависимости уровня показателей ферментов АОЗ и СРО от генотипа пациентов основной и контрольной групп. Все полученные результаты оказались статистическими значимыми.
Таким образом, было выявлено, что носители мутантной гомозиготы по аллелю 2 (0/0) гена GSTP-1 (I105V) имеют более высокий показатель СРО, а также более высокий уровень ферментов АОЗ: каталазы, супероксиддисмутазы. Это также коррелирует с более тяжелым течением ДНП в данной подгруппе (уровень СКФ ниже, а уровень микроальбуминурии выше, чем у лиц с другими генотипами основной группы). Можно предположить, что этот полиморфный вариант гена вносит негативный вклад в течение ДНП, утяжеляя ее за счет повышения активности СРО.
Активность процессов СРО и ПОЛ многократно возрастает при СД 2-го типа, и уровень оксидативного стресса отличается высокими значениями, что подтверждается увеличением содержания продуктов СРО в крови (МДА) на фоне возрастания активности ферментов системы АОЗ (СОД, КАТ, Г-S-Т). Во многих исследованиях неоднократно обсуждалось влияние различных полиморфных вариантов генов, отвечающих за синтез ферментов окислительного стресса, на прогрессирование диабетической нефропатии [12, 13, 14]. По данным литературных источников также была установлена ассоциация аллеля (0/0) гена GSTP1 (I105V) с повышенным риском развития бронхиальной астмы [15]. Присутствие данного аллеля также является фактором риска развития рака яичников и рака легких [16, 17]. Однако работ, рассматривающих влияние полиморфных вариантов генов, ферментов 2-й фазы биотрансформации ксенобиотиков на степень тяжести ДНП, нами найдено не было. При исследовании различных полиморфизмов гена GSTP-1 (I105V) в нашей работе наиболее яркое влияние на ферменты АОС и СРО, а также на уровень СКФ и микроальбуминурии оказывает мутантной гомозиготный полиморфизм по аллелю 2 (0/0), что коррелирует с данными из литературных источников. Данный феномен можно объяснить тем, что происходит снижение активности фермента Г-S-T, это подтверждается полученными результатами (уровень данного фермента в подгруппе с генотипом (0/0) самый низкий). Снижение активности этого фермента может приводить к недостаточности 2-й фазы биотрансформации ксенобиотиков, накоплению активных промежуточных электрофильных метаболитов и повышению уровня СРО и ПОЛ, что коррелирует со степенью тяжести нефропатии в этой когорте пациентов и доказывает влияние свободнорадикального повреждения на развитие диабетической нефропатии. Ферменты второй фазы отвечают за конъюгацию промежуточных продуктов метаболизма с эндогенными молекулами (глутатион, глюкуроновая кислота, сульфатная, метильная группа). Липофильный ксенобиотик становится гидрофильным, что обусловливает возможность его быстрой экскреции (через почки, ЖКТ или с выдыхаемым воздухом). Высокая активность ферментов второй фазы говорит о высокой «токсичной» нагрузке на организм, что подтверждается и высоким уровнем МДА – маркера процессов СРО. На фоне высокой активности ферментов АОЗ и уровня продуктов СРО у лиц с данным полиморфизмом определяются высокий уровень креатинина, низкая СКФ и более выраженная протеинурия, чем у носителей других вариантов полиморфизмов данного гена. Повышение активности ферментов АОЗ и уровня продуктов СРО в биологических средах наблюдаемых пациентов может свидетельствовать об активации цитотоксических процессов в организме. Свободнорадикальное повреждение клеток нефрона, а также сосудов и нервов, кровоснабжающих и иннервирующих почку, вместе с глюкозотоксичностью приводит к формированию очагов гломерулосклероза. Именно гломерулосклероз является основной причиной прогрессирующего снижения функции почек, что лабораторно проявляется повышением уровня креатинина, снижением СКФ и нарастанием протеинурии.
Выводы
Выявление мутантного гомозиготного (0/0) полиморфизма гена GSTP-1 (I105V) сочетается с достоверным снижением уровня фермента Г-S-T в крови и повышением уровня МДА – основного маркера СРО (в сравнении с показателями контрольной группы). Также данный полиморфный вариант приводит к повышению микроальбуминурии, повышению уровня креатинина и снижению уровня СКФ у пациентов с СД 2-го типа и ДНП. Это, вероятно, связано с нарастанием окислительно-восстановительного стресса и свободнорадикальным повреждением нефронов. Данный подход позволяет на ранней стадии предположить развитие тяжелой нефропатии, своевременно осуществить мероприятия по ее профилактике и коррекции и предупредить раннее развитие таких тяжелых осложнений ДНП, как анемия, артериальная гипертензия, патология фосфорно-кальциевого обмена, дислипидемия, протеинурия и др.