Scientific journal

Modern problems of science and education

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

Частота первично-множественных злокачественных опухолей (ПМЗО), характеризующихся наличием двух или более первичных неоплазм у одного пациента, варьирует в разных странах от 0,52% до 11,7% всех злокачественных новообразований [1; 2]. В России, как и во всем мире, наблюдается неуклонный рост количества больных с ПМЗО [3; 4]. За период с 1991 по 2000 г. число заболевших ПМЗО выросло с 1,9 до 5,5 и в 2020 г. достигло 36,0 на 100 тыс. населения [5].

Увеличивающаяся с каждым годом заболеваемость ПМЗО, наряду с определенными сложностями диагностики и лечения [6], обусловливает необходимость изучения патогенеза этой онкологической патологии, в том числе с использованием экспериментальных моделей. В нашем центре разработана модель ПМЗО, позволяющая оценить взаимовлияние двух опухолей: меланомы В16/F10 и карциномы легких Льюиса, растущих у мышей BALB/c Nude (Патент № 2759487) [7]. Ранее было показано влияние различных коморбидных патологий, в частности хронической нейропатической боли, на течение меланомы В16/F10 у мышей [8].

Известно, что все функции организма, в том числе функционирование регуляторных осей (гипоталамо-гипофизарно-гонадной оси и др.), находятся под контролем коры головного мозга. К важным регуляторным факторам относится семейство белков нейротрофинов, которые регулируют выживание нейронов, синаптическую функцию и высвобождение нейротрансмиттеров, а также определяют пластичность и рост аксонов в центральной и периферической нервной системе [9].

К нейротрофинам относятся фактор роста нервов (NGF), нейротрофический фактор мозга (BDNF), нейротрофин-3 (NT-3) и нейротрофин 4/5, имеющие значительную структурную гомологию [10]. NGF оказывает свое влияние на рост и выживание периферических сенсорных и симпатических нейронов и ряда нейронов головного мозга, предполагается его модулирующая роль в нейро-иммуно-эндокринных механизмах, имеющих жизненно важное значение в регуляции гомеостатических процессов [11]. BDNF является важным нейротрофином и нейротрансмиттером для многих функций мозга, оказывает нейропротекторное и стимулирующее рост действие на различные популяции нейронов после повреждения [9; 12; 13]. NT-3 представляет собой многофункциональный нейротрофический фактор, играющий важную роль в обеспечении пролиферации, выживания и дифференцировки нейрональных клеток-предшественников [14]. За счет активации своих рецепторов NT-3 снижает клеточное повреждение, улучшает регенерацию нейронов в различных моделях повреждений или нейродегенерации и участвует в синаптической реорганизации, формировании синапсов и пластичности нейронов [15]. Ранее нами было показано, что уровень и состав нейротрофинов в ткани головного мозга крыс и мышей с нокаутом гена урокиназы изменялся при росте экспериментальных злокачественных опухолей [16; 17].

Учитывая актуальность экспериментального изучения патогенеза ПМЗО и предполагаемую роль метаболических нарушений головного мозга в возникновении длительной стрессовой нагрузки, способствующей онкогенезу, целью данной работы было исследовать содержание нейротрофинов - BDNF, NGF и NT-3 в коре головного мозга мышей обоего пола при различных вариантах роста опухоли.

Материал и методы исследования

Исследование было проведено на 56 мышах обоего пола линии BALB/cNude, 8-9-недельного возраста с массой тела 21-22 г, полученных из ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА» (филиал «Андреевка», Московская область). Животные содержались в одинаковых условиях при естественном режиме освещения, температуре воздуха 22-26 °С, относительной влажности воздуха 40–75%, со свободным доступом к воде и пище. Работа с животными проводилась в соответствии с правилами «Европейской конвенции о защите животных, используемых в экспериментах» (Директива 86/609/ЕЕС). Протокол экспериментального исследования был одобрен Комиссией по биоэтике ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России от 01.09.2020, протокол этического комитета № 21/99.

Животные были разделены на 7 групп (по 8 мышей в каждой): 4 группы самок (интактные, мыши со стандартной подкожной перевивкой меланомы В16/F10 или карциномы Льюиса, мыши с воспроизведением модели ПМЗО – подкожное введение ниже правой лопатки 0,5 мл взвеси опухолевых клеток мышиной меланомы В16/F10 и ниже левой лопатки 0,5 мл опухолевой взвеси карциномы Льюиса); 3 группы самцов (интактные, мыши со стандартной подкожной перевивкой меланомы В16/F10, мыши с воспроизведением модели ПМЗО – подкожное введение ниже правой лопатки 0,5 мл взвеси опухолевых клеток мышиной меланомы В16/F10 и ниже левой лопатки 0,5 мл опухолевой взвеси карциномы Льюиса, за исключением карциномы Льюиса, которая при перевивке в самостоятельном варианте у самцов не воспроизводилась). Во всех вариантах перевивки взвесь опухолевых клеток готовили на физиологическом растворе в разведении 1:20, при этом в 0,5 мл взвеси содержалось 0,5 млн опухолевых клеток. Для определения размера опухоли измеряли с помощью штангенциркуля и рассчитывали объем опухоли по формуле: V=a×b×c (где a, b и c – линейные размеры в см).

Мышей умерщв­ляли на гильотине на 21-й день после перевивки опухолей. Для исследования забирали на льду органы и готовили 1% цитозольные фракции на 0,1М калий-фосфатном буфере рН 7.4, содержащем 0,1% Твин-20 и 1% БСА. В цитозольной фракции гомогенатов коры головного мозга определяли методом ИФА содержание нейротрофинов: BDNF (R&D System, США, Канада), β-NGF, NT-3 (RayBiotech, США).

Статистическую обработку полученных результатов проводили на персональном компью­тере посредством программы Statistica 10.0 при помощи параметрического критерия Стьюдента, поскольку, как показала предварительно проведенная проверка, данные всех групп соответствовали закону о нормальном распределении. В таблицах результаты представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка среднего (M±m).

Результаты исследования и их обсуждение

Нами исследованы три из представителей семейства нейротрофинов, полученные данные представлены в таблице 1.

Таблица 1

Содержание нейротрофинов в коре головного мозга мышей при разных вариантах злокачественного роста

Примечание: р – статистическая значимость различий по отношению к показателю у интактных животных соответствующего пола.

Согласно результатам проведенного анализа, в коре головного мозга мышей обоего пола уровни BDNF и NT-3 при меланоме В16 не имели значимых отличий от показателей у интактных животных соответствующего пола, а уровень NGF был ниже: у самок в 2,8 раза, а у самцов в 1,5 раза.

При сочетанном росте меланомы В16 и карциномы Льюиса у самок уровни BDNF и NT-3 были повышены относительно показателя у интактных животных в 1,4 раза и 1,3 раза соответственно, а уровень NGF был снижен в 2,6 раза. В то время как у самцов уровни BDNF и NGF были снижены относительно интактных животных в 2,6 и 3,0 раза (р=0,000000 для всех выше указанных показателей), уровень NT-3 не имел значимых отличий.

При самостоятельном росте LCC у самок повышенным был только уровень BDNF – в 1,7 раза, тогда как уровни NGF и NT-3, напротив, были снижены в 2,2 и 1,2 раза (р˂0,0001) соответственно относительно показателей у интактных самок.

В настоящем исследовании особенно интересные изменения были выявлены для наиболее важного для мозга нейротрофического фактора – BDNF. При этом на модели ПМЗО (сочетанное развитие двух гистологически различных опухолей) было обнаружено разнонаправленное изменение показателя. У самок имело место статистически значимое увеличение данного фактора, которое наблюдалось и при самостоятельном росте карциномы Льюиса, а у самцов уровень BDNF, напротив, был снижен более чем в 2,5 раза относительно интактных мышей. В то же время при самостоятельном росте меланомы В16 уровень BDNF и у самок, и у самцов не имел значимых отличий от показателя соответствующих интактных животных.

В недавних исследованиях показано, что BDNF высоко экспрессируется в области гипоталамуса и коры головного мозга, и его экспрессия значительно изменяется в ответ на стресс. Тем самым этот нейротрофин может быть посредником в отрицательном воздействии стресса на мозг [18]. Следовательно, изменение уровня BDNF в ту или иную сторону можно рассматривать как нарушение передачи сигналов в коре головного мозга мышей, что, по нашим данным, характерно для состояния стресса при самостоятельном росте карциномы Льюиса у самок и сочетанном росте двух опухолей у животных обоего пола. Снижение уровня BDNF у самцов в отличие от самок можно связать с тем, что их эндокринные уровни более стабильны по сравнению с самками [19], что способствует большей относительной стрессоустойчивости. В отличие от BDNF, фактор роста нервов (NGF) был снижен при всех вариантах – самостоятельном росте опухоли или сочетанном у животных обоего пола. Поскольку многочисленными исследованиями последних лет [20-23] доказана способность NGF улучшать рост и дифференцировку сенсорных и симпатических нервных клеток, повышать миелинизацию и тем самым способствовать пластичности мозга, выявленное нами снижение данного фактора в ткани мозга мышей дает возможность говорить о снижении пластичности мозга при указанных видах онкопатологии у мышей обоего пола. При этом наиболее выраженным 2,5-3 кратным было снижение NGF при сочетанном росте опухолей, т.е. на модели ПМЗО.

Изменения NT-3 были численно менее выраженными, чем кратные изменения BDNF и NGF, однако этот фактор наиболее разнообразно реагировал на рост опухоли у самок и самцов при различных вариантах: поднимался у самок при сочетанном росте, пытаясь компенсировать резко сниженный NGF при повышенном BDNF, снижался у самок при самостоятельном росте карциномы Льюиса и не изменялся при самостоятельном росте меланомы В16 у животных обоего пола и сочетанном росте опухоли у самцов. Оценка роста опухолей и продолжительности жизни животных при использованной в данной работе модели ПМЗО показала зависимость данных параметров от пола животных (табл. 2).

Таблица 2

Размер опухолей и продолжительность жизни животных при различных вариантах роста опухоли

Примечание: р1 – статистическая значимость отличий по сравнению с изолированным ростом меланомы В16/F10, р2 – по сравнению с изолированным ростом карциномы Льюиса, р3 – статистическая значимость отличий карцинома Льюиса от меланомы в модели ПМЗО.

В таблице представлен объем опухоли на 22-е сутки после перевивки. У мышей самок BALB/c Nude сочетанная перевивка меланомы B16/F10 и карциномы Льюиса увеличивала злокачественный потенциал меланомы и уменьшала злокачественный потенциал карциномы Льюиса [7], что выражалось в увеличении объема меланомы на 76,7% и уменьшении объема карциномы Льюиса на 57,2% по сравнению с размерами опухолей при самостоятельном росте. В отличие от самок, у мышей самцов сочетанная перевивка, хотя и сопровождалась ростом обеих опухолей – меланомы B16/F10 и карциномы Льюиса, однако объем меланомы был более чем в 2,5 раза (на 61,1%) меньше, чем при самостоятельном варианте роста [24]. При этом следует отметить, что у самцов BALB/c Nude не удалось воспроизвести в самостоятельном варианте карциному Льюиса. Продолжительность жизни при сочетанной перевивке (модель ПМЗО) была практически одинаковой у самцов и самок, но для животных обоего пола статистически значимо меньше, чем при самостоятельной перевивке. У самок снижение составило 12,8% по сравнению с меланомой B16/F10 и 20,9% по сравнению с карциномой Льюиса, а у самцов снижение продолжительности жизни при ПМЗО достигло 23,1% по сравнению с животными при самостоятельном росте меланомы B16/F10.

Таким образом, при самостоятельной перевивке мышиной меланомы B16/F10 и карциномы Льюиса самкам мышей линии BALB/c Nude опухоли росли до сопоставимых объемов, тогда как у самцов линии BALB/c Nude в самостоятельном варианте удалось получить только меланому B16/F10. При сочетанной перевивке, т.е. при первично-множественном злокачественном росте обе опухоли развивались у всех животных вне зависимости от пола, но их размер у самок был больше, чем у самцов. Снижение продолжительности жизни при ПМЗО было характерно для животных обоего пола.

При сопоставлении содержания наиболее важного для мозга нейротрофина BDNF с размерами опухолей, характеризующими выявленную специфику злокачественного роста между самцами и самками при ПМЗО, оказалось, что у самок, у которых размер обеих опухолей в 2-3 раза превосходил соответствующие объемы у самцов, уровень BDNF в ткани мозга был почти в 4 раза выше, чем у самцов, у которых при ПМЗО зафиксировано наиболее низкое содержание этого нейротрофина – в 2,6-4,5 раз меньшее по сравнению со всеми остальными группами животных, как с опухолевым ростом, так и интактными мышами. Это свидетельствует о несомненном вкладе данного регулятора синаптической передачи, и функциональной активности коры головного мозга в целом, в особенности полинеоплазии у самцов и самок мышей с врожденным иммунодефицитом (Balb/c Nude).

Заключение

Анализ содержания нейротрофинов в коре головного мозга у самок и самцов мышей линии BALB/c Nude показал, что у интактных животных по уровню BDNF и NT-3 половые различия были минимальными, только уровень NGF у самок был в 1,5 раза выше. При самостоятельном росте меланомы В16 в коре головного мозга мышей обоего пола происходили сходные изменения уровня нейротрофинов, заключавшиеся в снижении только содержания NGF. Более выраженные половые различия отмечены при сочетанном росте меланомы В16 и карциномы Льюиса. В коре головного мозга самок повышался уровень BDNF и NT-3 (в 1,4 и 1,3 раза), но снижался уровень NGF (в 2,6 раза), тогда как у самцов уровень BDNF и NGF был снижен (в 2,6 и 3 раза), а уровень NT-3 не имел достоверных отличий от показателя у интактных животных соответствующего пола.

Сопоставление выявленных половых различий в направленности изменений уровней нейротрофинов при различных вариантах роста опухолей и динамики развития злокачественного процесса у самцов и самок позволяет прийти к заключению об участии нейротрофинов коры головного мозга в реализации программ опухолевого роста у животных разного пола, возможно, сопряженного с проявлениями хронического стресса. Полученные данные подтверждают наличие половой специфичности в нарушении при ПМЗО центральных регуляторных систем, существенная роль в которых принадлежит нейротрофинам, и прежде всего нейротрофическому фактору мозга – BDNF, изменения содержания которого в коре головного мозга имели противоположную направленность у самцов и самок.