По мере развития биологических и медицинских наук важность выбора метода криоконсервации разных видов биологического материала становится все более актуальной. Длительное сохранение жизнеспособности образца позволяет решать ряд логистических и методологических проблем в различных областях биологии, экспериментальной и клинической медицины, животноводства, сельского хозяйства и культивации растений. Критическое значение проблема оптимизации способов криоконсервации животных тканей имеет в области трансплантологии органов и создании пациентоподобных моделей при проведении доклинических исследований [1].
Целью обзора явилось обобщение данных отечественных и зарубежных исследований и формирование представления об отличительных особенностях различных способов криоконсервации, используемых в различных областях современной науки.
Материалы и методы исследования
Был проведен анализ отечественной и зарубежной литературы, посвященной использованию различных способов криоконсервации органов и тканей, а также биосовместимости различных криопротекторных агентов. Выполнен поиск тематических статей в базе данных Google Scholar с использованием запросов: криоконсервация, виды криопротекторов, токсичность антифризных агентов, биосовместимость криопротекторов, cryopreservation in oncology, cryopreservation and it’s clinical application, impact of immediate cryopreservation on xenografts creation, PDX-Derived Organoids cryopreservation, cryopreservation of human cancer, cell lines cryopreservation, general principles of preclinical study design, а также NCBI Pubmed с использованием поисковых запросов: cryopreservation for preclinical research, tissue cryopreservation, cell culture cryopreservation, organoids cryopreservation, tumor bio banking.
Результаты исследования и их обсуждение
К основным способам криоконсервации биологического материла относят методы медленного замораживания (ММЗ) и витрификации (МВ), которые отличаются скоростью охлаждения и механизмами восстановления клеточного гомеостаза [2]. Использование ММЗ предполагает постепенную остановку метаболической активности в присутствии криопротекторов (КПР) в низкой концентрации, что позволяет минимизировать цитотоксические эффекты последних. Оптимальным режимом в отношении клеток млекопитающих является охлаждение на 1°C в минуту. Данная стратегия является особенно актуальной для сохранения жизнеспособности образцов в области вспомогательных репродуктивных технологий. Отдельные половые клетки, эмбрионы, а также первичные клеточные линии могут быть успешно консервированы, в то время как сохранение сложных образцов путем длительной заморозки является затруднительным. Основной причиной ограничения широкого применения ММЗ является невозможность поглощения криопротектора многослойными образцами, необходимость использования дорогостоящего оборудования, а также образование кристаллов льда из остаточной воды [3; 4].
Сохранение при глубоких криогенных температурах может быть достигнуто с помощью МВ, предполагающего быстрое охлаждение биологического материала в среде, содержащей высокие концентрации криопротекторных агентов. Основным преимуществом МВ является предупреждение формирования льда, что играет ключевую роль в сохранении структурной организации тканей и фрагментов органов как при заморозке, так и при оттаивании образца [5; 6].
Описанные способы сохранения жизнеспособности клеток применяют в изохорном и изобарическом подходе криоконсервации. Гипербарический подход криосохранения образца предполагает использование низких температур в сочетании с высоким давлением, которое постепенно снижают для достижения оптимума [7; 8].
Криопротекторы и их токсические эффекты
Криопротекторы представляют собой вещества, уменьшающие содержание внутрицеллюлярной воды и увеличивающие общую концентрацию растворенных веществ, предупреждающие, таким образом, повреждение клеток кристаллами льда путем повышения вязкости и образования водородных связей [9].
Интрацеллюлярная вода представлена объемной (не менее 90%) и связанной формами. Связанная вода, осмотически не покидающая клетку, сообщается с гидрофильными поверхностями макромолекул (белков, нуклеиновых кислот или полярных концевых групп фосфолипидов). Удаление объемной воды не вызывает повреждение, опосредованное обезвоживанием, в то время как удаление связанной воды вызывает химические взаимодействия макромолекул, лишенных оболочки [10].
Вредное воздействие низких температур объясняется двумя механизмами, первый из которых предполагает механическое повреждение клеточных мембран кристаллами льда, что делает невозможным сохранение интактных клеток после оттаивания. Второй механизм обусловлен летальным увеличением концентрации растворенных веществ в оставшейся жидкой фазе [11].
Дегидратация цитоплазмы клеток становится причиной денатурации или структурной модификации белков. Формирование экстрацеллюлярных кристаллов льда в пространстве приводит к нарушению организации внеклеточного матрикса, что неизбежно сказывается на работе белков, регулирующих межклеточные взаимодействия, и становится серьезной проблемой криоконсервации многослойных образцов: тканей, фрагментов опухолей, органов. Таким образом, подходы к оптимизации способов длительного сохранения жизнеспособности должны основываться на соблюдении баланса между обезвоживанием и образованием льда.
Принцип цитопротективного действия антифризных соединений был описан Mazur и коллегами (1963). Показано, что при оптимально медленном замораживании происходит выход воды из клетки путем осмоса в ответ на резкое повышение концентрации КПР во внеклеточном пространстве. Обезвоженные клетки начинают спадаться, при этом проникающие криопротекторы заменяют воду, покинувшую клетку. Таким образом, использование интрацеллюлярных КПР приводит к последующему набуханию клеток, в то время как при применении экстрацеллюлярных соединений клетки остаются спавшимися. Проникающие агенты должны быть хорошо растворимыми в воде при низких температурах, способными легко пересекать биологические мембраны и минимально токсичными [12; 13]. Принцип работы проникающих антифризов основан на увеличении внутриклеточной концентрации растворенного вещества и снижении осмотической разницы между цитозолем и внеклеточной средой. Сохранение большого объема интрацеллюлярной воды повышает вероятность формирования кристаллов льда, также приводящих к нарушению целостности клеточных мембран [14].
Альтернативой описанным способам криоконсервации является быстрое погружение биологического материала в жидкий азот, что позволяет минимизировать эффекты обезвоживания, делая внутри- и внеклеточную воду вязкой и предотвращая ее переход в твердое агрегатное состояние [15].
В условиях чрезмерно быстрого охлаждения существует опасность повреждения клеток кристаллами льда, образование которых связано с тем, что интрацеллюлярный лед образуется раньше, чем клетка успевает подвергнуться дегидратации. Слишком медленное замораживание, напротив, приводит к длительному воздействию гипертонического раствора криопротектора, вследствие чего клетки страдают от необратимого обезвоживания. Таким образом, оптимизация скорости охлаждения образца является одним из ключевых факторов сохранения целостности биологического материала, подвергшегося криоконсервации [16]. Стратегия оптимизации методов криосохранения должна быть состредоточена на ингибировании рекристаллизации льда при оттаивании образцов, а также использовании в качестве замораживающих смесей малотоксичных и биосовместимых компонентов среды для консервации.
Антифризные соединения могут проявлять специфическую токсичность в отношении отдельных типов биологического материала или обладать общей токсичностью вследствие замещения объемной воды. Проблема общей токсичности является главным недостатком витрификационных растворов. Такое неспецифическое дегидратационное повреждение может быть предупреждено использованием смеси криопротекторов интра- и экстрацеллюлярного типа [17]. Специфическая токсичность становится причиной денатурации белков, модификации биомолекул, повреждения клеточных мембран, дестабилизации цитоскелета, а также истощения АТФ, которое становится причиной окислительного стресса. Развитие окислительных модификаций представляется наиболее критичным для чувствительных к гипоксии сердечной и нервной тканей. Понимание молекулярных механизмов токсичности криопротекторов может стать важным шагом на пути к поиску средств снижения токсичности [18].
К основным компонентам интра- и экстрацеллюлярных криопротекторов относят раствор-носитель и собственно криопротектор. В состав носителя, поддерживающего изотоническую концентрацию, входят соли, буферные растворы, осмогены, а также ингибиторы апоптоза [19].
Проникающие антифризные агенты
С 1959 года стандартный протокол криосохранения клеток млекопитающих включает замораживание в растворе диметилсульфоксида (ДМСО), проникающего низкомолекулярного агента [20]. ДМСО предотвращает кристаллизацию воды во вне- и внутриклеточном пространстве, частично сдерживая увеличение концентрации растворенных веществ во время замораживания. Его использование ограничено в отношении образцов, которые используют при трансплантации тканей или терапии стволовыми клетками. В ряду экспериментальных работ были продемонстрированы токсические эффекты при трансплантации клеток костного мозга, которые подвергали криосохранению в растворе ДМСО. Наблюдаемые побочные эффекты КПР были связаны с увеличением продукции свободных радикалов, изменением эпигенетического профиля и гиперметилированием в клетках сердца и печени. Отмечались нарушение морфологии и снижение жизнеспособности нейрональных клеток, агрегация белков и апоптоз астроцитов [21; 22].
Для минимизации токсических эффектов ДМСО используют в комбинации с бычьей эмбриональной сывороткой (FBS). FBS, как компонент среды для заморозки, выступает в роли буфера осмотического давления, снижающего риск рекристаллизации. Однако очистка биологического материала от сыворотки представляет собой дорогостоящий процесс [23].
В качестве одного из наиболее безопасных интрацеллюлярных антифризов рассматривают глицерин, чьи криозащитные свойства относительно слабы. Коллигативный механизм протекторного действия глицерина сходен с таковым при использовании ДМСО и направлен на регуляцию концентрации растворенных веществ во внеклеточном пространстве при дегидратации образца [24]. Низкая токсичность глицерина определяет возможность широкого применения данного КПР в криоконсервации разнообразных типов биологического материла. Так, в работе Карамулдаева А.К. и Тихомирова А.М.(2017) продемонстрирована эффективность использования глицерина при криосохранения спермы осетровых рыб. Показана высокая жизнестойкость половых клеток при применении глицерина по сравнению со стандартными протоколами (ДМСО) [25]. Наблюдаемая эффективность позволяет рассматривать глицерин в качестве эффективного КПР.
Этиленгликоль (ЭГ) представляет собой один из основных антифризных агентов, применяемый как при ММЗ, так и при МВ эмбрионов млекопитающих. Криопротекторные свойства ЭГ связаны с низкой молекулярной массой, высокой проникающей способностью и низкой токсичностью в отношении ооцитов, сперматозоидов и эмбрионов человека и животных. Переход к использованию ЭГ для сохранения жизнеспособности эмбрионов в протоколах МВ привел к скачку результативности проведения процедуры экстракорпорального оплодотворения в конце 90-х годов [26].
Непроникающие антифризные агенты
К группе непроникающих КПР относят сахара, способные вступать во взаимодействие с полярными группами биомолекул [27]. Рядом авторов смеси сахаров и полиолов рассматриваются в качестве естественной эвтектической системы, которая может быть альтернативным вариантом водного и липидного обмена для некоторых клеток [28]. Показано, что использование смеси трегалозы и глицерина в отношении 1:30 демонстрирует сохранение структурной организации биоматериала и низкую токсичность относительно синтетических непроникающих антифризных агентов. Применение естественных эвтектических смесей в криоконсервации позволит минимизировать токсические эффекты и снизить стоимость стандартно используемых органических растворителей в качестве КПР [27; 29].
К синтетическим экстрацеллюлярным криопротекторам относят поливинилпиролидон (ПВП), повышающий вязкость замораживающего раствора путем образования связей с молекулами воды. Точный механизм предупреждения образования кристаллов льда ПВП неизвестен, однако была продемонстрирована возможность применения ПВП в сочетании с другими КПР для замораживания ооцитов крупного рогатого скота [30].
Полиамфолиты
В последние годы активно обсуждается возможность использования ионообменных макромолекулярных антифризных агентов на основе амфолитной структуры. Эффективность применения сополимера диметиламинопропилметакриламида и акриловой кислоты, карбоксилированного поли(ε-лизина)-полиамфолита, а также in situ гидрогелей на основе декстрана способствует не только длительному сохранению жизнеспособности клеток, но и успешному восстановлению после оттаивания биоматериала. Для криосохранения клеточного монослоя оптимально использование полиамфолитов, как компонентов сложных смесей ДМСО, сахарозы и ЭГ [31-33].
Антифризные белки
Заинтересованность физиологическими особенностями животных - экстремофилов, живущих в среде с температурой ниже точки замерзания воды, привела к выделению специфических белков, блокирующих повреждение клеток кристаллами льда. Впервые антифризные белки (АФБ) были обнаружены у арктических рыб в 1957 году. Принцип действия АФБ состоит в явлении теплового гистерезиса (ТГ), предполагающего изменение температуры замерзания воды. ТГ ингибирует рост льда, оставляя «зародышевые» кристаллы безопасными для клетки до тех пор, пока температура не станет ниже и не начнутся вторичные события нуклеации [34]. В отличие от коллигативного действия многоатомных спиртов и сахаров, цитопротекторные свойства АФБ не зависят от количества их молекул. Такая неколлигативная природа позволяет рассматривать данные агенты в качестве нетоксичной альтернативы синтетическим антифризам. К ограничениям применения относят высокую вероятность иммунного ответа при использовании АФБ в консервации органов и тканей, необходимых в области терапии и трансплантологии [35].
Наиболее распространенным АФБ является Серицин – водорастворимый белок с молекулярной массой ∼30 кДа. Серицин выделяют из коконов тутового шелкопряда для замещения FBS в антифризных растворах для криосохранения стволовых клеток [36].
В работе Pollock K. и соавторов (2016) был проведен сравнительный анализ криопротекторных эффектов различных смесей КПР и осмолитов на основании оценки жизнеспособности мезенхимальных стволовых клеток после оттаивания. Авторами были описаны явления лучшего восстановления образцов, подвергшихся сохранению в многокомпонентных антифризных растворах, не содержащих ДМСО [37]. Наблюдаемые закономерности позволяют рассматривать переход к использованию многокомпонентных смесей КПР в качестве одного из наиболее доступных способов оптимизации протоколов криосохранения биологического материала.
Практическое применение антифризных агентов
Несмотря на то что с момента проведения первой процедуры трансплантации органов человеку, осуществленной Джозефом Мюрреи в 1954 году, было произведено множество пересадок, существующие подходы к замещению органов, утративших функциональность, удовлетворяют лишь 10% существующей мировой потребности в трансплантации [38]. Стандартные методы сохранения донорского материала неэффективны и сокращают экстракорпоральный срок службы органа. Рекомендованное хранение органов ex vivo осуществляется посредством статического холодного хранения при 4-8 °С. Однако данный подход обеспечивает функциональное состояние лишь на несколько часов. В настоящее время период возможной консервации колеблется от 4 до 36 часов в зависимости от органа, что ограничивает возможность проведения качественной оценки соответствия антигенов лейкоцитов реципиентов и транспортировки донорского материала, соответствующего иммунологическому фенотипу пациента. С целью коррекции побочных эффектов реципиентам назначают пожизненную иммуносупрессивную терапию [39].
Ряд протоколов криосохранения предполагает погружение органов в консервирующие растворы. Примером таких КПР является раствор VS55, применяемый при МВ. Результативность такого подхода была описана при криосохранении почек лабораторных животных. По мере увеличения объема донорского материала наблюдается повышение вероятности отторжения из-за девитрификации и термомеханического стресса больших органов, вызванного формированием температурных градиентов [40], в связи с чем перспективным подходом к оптимизации процедур замораживания/оттаивания является обеспечение равномерного контролируемого оттаивания в направлении от периферии к центру органа.
Проведение исследований в области экспериментальной медицины также требует модификации способов криоконсервации с целью сохранения уникальных клеточных культур и фрагментов тканей. Низкое качество этих исследований снижает достоверность получаемых результатов. Для проведения доклинических исследований (ДКИ), являющихся обязательным этапом проверки эффективности и степени токсичности новых фармакологических субстанций и комбинаций стандартных препаратов с целью внедрения последних в клиническую практику, требуются модели, способные адекватно отражать ключевые особенности заболеваний. ДКИ могут быть разделены на два основных подтипа: проведение исследований in vitro и in vivo [41]. Сохранение жизнеспособности образцов опухолевых клеток может быть достигнуто с помощью заморозки образцов в 2D- и 3D-формате.
В качестве носителя для заморозки клеток часто используют бумагу и пластик, однако сохранение монокультур в двумерном формате демонстрирует низкую эффективность при трансплантации животным-реципиентам из-за отсутствия межклеточных взаимодействий и связей отдельных клеточных субпопуляций [42; 43]. Современные системы совместного культивирования позволяют воссоздавать гетерогенность биологического материала, что приводит к повышению эффективности при криоконсервации и последующей трансплантации.
В качестве одного из путей преодоления проблемы отсутствия межклеточного взаимодействия рассматривается использование скаффолдов из различных биосовместимых материалов. Данная стратегия позволяет создавать трехмерные (3D) модели с несколькими клеточными популяциями, а также сложные системы, которые восстанавливают тканеподобную архитектуру первичных и паспортизированных культур. 3D-моделирование активно применяют на практике для культивации взрослых стволовых клеток для получения фрагментов органов. Криоконсервация отдельных фрагментов условно здоровой и опухолевой тканей также может осуществляться в составе композиционных конструкций, характеризующихся биологической инертностью и совместимостью с животными тканями. Использование каркасов позволит минимизировать необходимость использования больших концентраций КПР при применении в МВ [30; 44-46].
Заключение
Основные стратегии криоконсервации включают два основных криопротекторных механизма: образование стекловидной фазы и обратимую дегидратацию клеток. Однако используемые методы несовершенны, что связано с трудностями сохранения фенотипических и функциональных особенностей биологического образца. Существует потребность в низкотоксичных биосовместимых криозащитных агентах. Для преодоления ограничений использования антифризов широко применяют криопротекторы различной химической природы в композициях, а также различные темпы и форматы замораживания/оттаивания.