Проблема гиподинамии в современном обществе стоит особенно остро. Согласно данным Всемирной организации здравоохранения, гиподинамия и адинамия представляют собой настоящую пандемию, ежегодно затрагивающую огромное количество населения разного пола, возраста и социального статуса. Борьба с гиподинамией ведется постоянно, в первую очередь за счет популяризации физкультуры и спорта высоких достижений [1]. Имеющиеся в настоящий момент данные показывают, что умеренные физические нагрузки могут успешно препятствовать возникающим при гиподинамии патологическим изменениям в организме. Однако по мере прогрессирования и улучшения спортивных результатов неизбежно развитие физического и психологического истощения, что, в свою очередь, приводит к функциональному спаду. С уменьшением эффективности тренировок сталкиваются как профессиональные спортсмены, так и спортсмены-любители. В связи с этим все большее значение приобретают методы и техники, позволяющие отсрочить наступление функционального спада, среди которых особенно выделяются фармакотерапевтические подходы. На сегодняшний день фармакология спорта – одно из стремительно развивающихся направлений медицинской науки, позволяющее поддерживать достигнутый уровень тренированности в оптимальном диапазоне [2]. Над этим работают различные специалисты. Для сохранения спортивного результата возможно использование лекарственных препаратов, относящихся к различным фармакотерапевтическим группам. Наиболее широко применяются средства адаптогенного, ноотропного действия и различные метаболические стимуляторы (креатин), антиоксиданты, актопротекторы [3]. Исследования последних лет показывают, что эффективными средствами коррекции физического и психического утомления могут быть вещества, изменяющие митохондриальную функцию и таким способом модулирующие метаболизм клетки. Основой для концепции митохондриального таргетинга в спортивной медицине послужили фундаментальные исследования патогенеза мышечного утомления. D. Constantin-Teodosiu et al., 2021, было показано, что как временное, так и хроническое мышечное утомление может быть связано с угнетением митохондриального биогенеза, сопровождаемого активацией гликолиза, накоплением лактата и истощением пула АТФ [4]. Снижение биогенеза митохондрий не только негативно отражается на энергообеспечении клетки, но и может выступать триггером иных патогенетических путей мышечного утомления, таких как окислительный стресс, апоптоз поперечно-полосатых миоцитов, гиперцитокиновый каскад и инсулинорезистентность [5]. В связи с этим логично предположить, что применение средств, увеличивающих митохондриальный биогенез, может благоприятно отражаться на функциональном состоянии скелетной мускулатуры. Ранее проведенные исследования показали, что производные хромона обладают митохондриоориентированным действием и способностью к модуляции метаболического статуса клетки [6], в связи с чем именно дериваты хромона были выбраны в качестве анализируемых соединений в данном исследовании.
Цель исследования. Оценить изменение митохондриального биогенеза на фоне введения новых производных хромона в условиях хронического мышечного утомления.
Материалы и методы исследования
Работа выполнена на 80 мышах-самцах Balb/c с массой тела 20–22 г. Животные были приобретены у питомника лабораторных животных «Рапполово» и во время эксперимента содержались в полипропиленовых боксах по 5 особей в контролируемых условиях окружающей среды: температура воздуха 20±20С, влажность воздуха 55–65%, суточный цикл 12 часов день / 12 часов ночь. Обращение с лабораторными животными и их содержание соответствовали требованиям Директивы 2010/63/EU Европейского Парламента и Совета Европейского Союза от 22 сентября 2010 г. по охране животных, используемых в научных целях.
Мышечное утомление воспроизводили у мышей методом «принудительного плавания с отягощением». Перед началом эксперимента животных взвешивали с точностью до 1,0 г и вычисляли массу нагрузки, равную 20% от массы тела животного. Груз фиксировали у основания хвоста животного. Далее мышей помещали в акриловый цилиндр с высотой стенок 0,3 м и диметром 0,15 м, заполненный водой с температурой 150С, фиксировали время плавания (в секундах) до полного истощения (за полное истощение принималось нахождение животного на дне бассейна без попыток всплытия на протяжении 10 секунд) [7]. На основании полученных результатов мышей рандомизировали на равные группы по 10 особей: группа интактных животных (ИН), группа негативного контроля (НК), группа мышей, которым вводили препарат сравнения – этилтиобензимидазол («Метапрот», Россия) в дозе 25 мг/кг [7], и группы животных, получавших исследуемые соединения под шифрами 3FC1, 3FC2, 3FC3, 3FC4 и 3FC5 в дозе 40 мг/кг [6]. После формирования экспериментальных групп повторно воспроизводили процедуру «принудительного плавания» (интактных мышей тестировали группами по 3, 3 и 4 особи соответственно). Плавание продолжалось на протяжении 10 дней (1 процедура в сутки). Исследуемые соединения и референс-препарат вводили per os за 60 мин до «принудительного плавания», при этом НК группа животных получала воду очищенную в эквивалентном объеме. На 11-й день эксперимента животных декапитировали под хлоралгидратной анестезией (350 мг/кг, интаперитонеально) и осуществляли забор четырехглавой мышцы бедра (m.quadriceps femoris). Мышечную ткань гомогенизировали в механическом гомогенизаторе Поттера в буферной системе с рН 7,2, состоящей из 1 ммоль/л ЭГТА, 215 ммоль/л маннита, 75 ммоль/л сахарозы, 0,1%-ного раствора бычьего сывороточного альбумина, 20 ммоль/л HEPES. Полученный гомогенат центрифугировали при 1400 g на протяжении 3 мин, после чего полученный супернатант переносили в пробирки типа «Эппендорф» и повторно центрифугировали при 18000 g на протяжении 10 минут. Полученный вторичный супернатант отбрасывали, осадок ресуспендировали в 0,5 мл изолирующего буфера и удаляли для проведения анализа [7]. В полученном биоматериале оценивали интенсивность митохондриального биогенеза путем определения активности сукцинатдегидрогеназы и цитохром-с-оксидазы.
Активность сукцинатдегидрогеназы определяли спектрофотометрически в реакции восстановления дихлорфенолиндофенола в среде, содержащей ротенон и сукцинат. Оптическую плотность регистрировали при 600 нм. [8]. Активность цитохром-с-оксидазы оценивали в ходе реакции окисления цитохрома С (II) при добавлении в анализируемую среду калия цианида [9].Оптическую плотность полученной смеси определяли при 500 нм.
Спектрофотометрический анализ выполнен с использованием системы УФ-спектрофотометра ПРОМЭКОЛАБ – ПЭ-5300В в кюветах с длиной оптического пути 1,0 см. Активность ферментов выражали в единицах действия (Ед) в пересчете на концентрацию белка в образце (мг белка). Содержание белка определяли методом Бредфорда.
Полученные результаты обрабатывали методами вариационной статистики. В ходе статистического анализа использовали пакет прикладных программ STATISTICA 6.0. (StatSoft, США). Нормальность распределения данных оценивали с применением теста Шапиро–Уилка. Однородность дисперсий определяли тестом Левена. Статистически значимые отличия между группами оценивали методом однофакторного дисперсионного анализа с пост-тестом Ньюмена–Кейлса (при нормальном распределении данных) или пост-тестом Краскелла–Уоллиса (при распределении данных, отличном от нормального) при критическом уровне значимости р<0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
Анализ изменения продолжительности плавания (табл. 1) показал, что у НК группы мышей на всем протяжении эксперимента выносливость имела тенденцию к снижению, начиная со 2-го дня плавания с нагрузкой. В итоге к концу исследования (на 10-й день) время плавания НК группы животных было меньше аналогичного у ИН мышей на 39,5% (p<0,05). Применение референс-препарата способствовало повышению физической активности животных. Так, у мышей, которым вводили Метапрот, продолжительность плавания на всем протяжении эксперимента была статистически значимо (p<0,05) выше таковой у НК группы животных. Пик работоспособности у данной группы животных отмечен на 9-й день эксперимента, когда время плавания животных, получавших референс-препарат, было выше аналогичного у НК группы мышей на 144,0% (p<0,05). Введение изучаемых производных хромона производило эффект, сопоставимый с препаратом сравнения. Так, на фоне применения веществ под шифрами 3FC1; 3FC2; 3FC3; 3FC4 и 3FC5 физическая активность мышей превосходила таковую у НК группы животных практически на всем протяжении исследования. Пиковое значение работоспособности для данных групп мышей наблюдалось раньше, чем в случае курсового введения референс-препарата, – на 5–7-е сутки эксперимента. На пике физической активности время плавания мышей, получавших соединения 3FC1; 3FC2; 3FC3; 3FC4 и 3FC5, статистически значимо превосходило аналогичные показатели НК группы животных: на 118,1%; 141,5%; 144,4%; 108,5% и 87,4% соответственно (все показатели p<0,05). Стоит отметить, что показатели пиковой работоспособности животных, получавших исследуемые вещества и референт, статистически значимо не отличались (таблица).
Таблица 1
Влияние исследуемых соединений и препарата сравнения на изменение продолжительности плавания животных в тесте «принудительное плавание с отягощением»
Группа |
ИН |
НК |
Метапрот |
3FC1 |
3FC2 |
3FC3 |
3FC4 |
3FC5 |
День 1 |
116,21±9,63 |
113,14±14 |
110,61±14,96 |
111,51±13,2 |
118,68±9,24 |
111,01±9,57 |
116,6±7,84 |
118,57±12,98 |
День 2 |
111,53±8,71 |
105,47±9,53 |
114,67±13,01 |
122,75±11,72 |
120,09±14,11 |
126,29±11,48 |
124,29±13,24 |
127,57±8,85 |
День 3 |
115,1±11,05 |
92,43±8,71 |
129,39±8,33* |
151,41±10,19* |
184,66±14,93* |
182,58±7,9* |
121,46±8,59* |
120,18±9,82* |
День 4 |
114,21±8,47 |
80,02±14,53# |
152,82±9,73* |
140,44±8,83* |
191,93±8,96* |
167,1±13,1* |
176,7±13,85* |
133,44±8* |
День 5 |
114,03±8,92 |
85,98±10,61# |
168,49±11,01* |
187,5±12,55* |
179,22±10,09* |
166,88±11,93* |
158,94±7,12* |
161,11±8,26* |
День 6 |
119,86±13,49 |
87,8±13,12# |
162,87±14,64* |
185,02±9,18* |
180,78±10,12* |
190,76±8,37** |
183,02±10,58* |
159,83±13,94* |
День 7 |
116,07±9,36 |
81,41±14,43# |
168,36±13,58* |
183,15±10,25* |
190,6±11,44* |
198,98±8,35* |
173,48±10,39* |
140,45±12,25* |
День 8 |
119,76±11,16 |
77,82±10,18# |
147,38±7,67* |
130,96±11,56* |
167,8±11,83* |
186,84±10,54* |
146,17±8,13** |
144,3±12,77* |
День 9 |
118,41±10,09 |
72,89±9,78# |
177,83±13,06* |
161,77±14,88* |
176,42±14,33** |
171,09±10,12* |
177,31±12,94* |
132,65±13,26* |
День 10 |
113,68±7,27 |
68,77±14,02# |
156,05±12,31* |
142,38±12,66* |
160,65±10,98* |
161,69±13,4* |
115,79±14,7* |
156,32±11,8* |
Примечание: ИН – интактные животные; НК – негативный контроль; Метапрот – группа мышей, получавших Метапрот; 3FC1-3FC5 – группы мышей, получавших исследуемые соединения; # – достоверно относительно ИН группы животных (тест Краскелла–Уоллиса, p<0,05); * – достоверно относительно НК группы животных (тест Краскелла–Уоллиса, p<0,05).
Активность митохондриальных ферментов (рисунок) в мышечной ткани у НК группы уменьшилась по отношению к ИН мышам: сукцинатдегидрогеназы – на 60,9% (p<0,05), цитохром-с-оксидазы – на 70,5% (p<0,05). Применение референс-препарата не оказало значимого влияния на изменение активности анализируемых ферментов, в то время как на фоне введения исследуемых соединений каталитические свойства сукцинатдегидрогеназы и цитохром-с-оксидазы статистически значимо увеличились по отношению к НК группе животных. Так, на фоне применения соединения 3FC1 активность сукцинатдегидрогеназы и цитохром-с-оксидазы повысилась на 44% (p<0,05) и 25% (p<0,05) соответственно; соединения 3FC2 – на 56% (p<0,05) и 75%(p<0,05); 3FC3 – на 80% (p<0,05) и 96,4%(p<0,05); 3FC4 – на 24% (p<0,05) и 39,2% (p<0,05) и соединения 3FC5 – на 32% (p<0,05) и 42,9% (p<0,05) соответственно. Стоит отметить, что активность митохондриальных ферментов у животных, получавших анализируемые вещества, была выше, чем у группы мышей, которой вводили референт (p<0,05).
Влияние исследуемых соединений и референс-препарата на изменение активности митохондриальных ферментов в мышечной ткани животных в условиях теста «принудительное плавание с отягощением»
Примечание: СДГ – сукцинатдегидрогеназа; ЦО – цитохром-с-оксидаза; ИН – интактные животные; НК – негативный контроль; Метапрот – группа мышей, получавших Метапрот; 3FC1-3FC5 – группы мышей, получавших исследуемые соединения; # – достоверно относительно ИН группы животных (тест Ньюмена–Кейлса, p<0,05); * – достоверно относительно НК группы животных (тест Ньюмена–Кейлса, p<0,05); Δ – достоверно относительно группы животных, которой вводили Метапрот (тест Ньюмена–Кейлса, p<0,05)
Полученные изменения свидетельствуют, что у животных в условиях истощающих физических нагрузок снижаются реакции митохондриального биогенеза, что может привести к метаболическому сдвигу в пользу анаэробных реакций обмена с резким падением уровня работоспособности. Применение референс-препарата способствовало восстановлению физической активности животных, но при этом для используемого в работе референта не было отмечено значимого влияния на изменение активности ферментов митохондриального происхождения. В то же время применение исследуемых производных хромона статистически значимо повышало активность как сукцинатдегидрогеназы, так и цитохром-с-оксидазы, что сопровождалось сопоставимым с референтом ростом физической активности мышей. Таким образом, можно предположить, что референс-препарат и изучаемые дериваты хромона действуют на разных уровнях регуляции метаболического состояния клетки. Метапрот известен как активатор синтеза РНК и соответствующих ферментов глюконеогенеза, который не оказывает прямого действия на изменение митохондриальной функции [10], тогда как производные хромона, напротив, улучшают внутриклеточный синтез макроэргов посредством повышения биогенеза митохондрий и соответственно повышения их активности.
Выводы
Курсовое применение производных хромона приводит к повышению физической активности животных в условиях теста «принудительное плавание с отягощением» в степени, сопоставимой с референс-препаратом – Метапротом. При этом основой для реализации фармакологического эффекта дериватов хромона может служить повышение митохондриального биогенеза и соответственно увеличение внутриклеточного пула макроэргических соединений при дефиците кислорода.