Scientific journal

Modern problems of science and education

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

Тромбоциты представляют собой безъядерные структуры дисковидной формы диаметром 1–4 мкм и толщиной 0,8 мкм, образующиеся из мегакариоцитов. Основной функцией кровяных пластинок является остановка кровотечения посредством образования тромбоцитарного тромба [1]. Морфологически пластинки состоят из ряда структурных органелл, таких как плазматическая мембрана, открытая канальцевая система, эндоплазаматический ретикулум, который образует плотную трубчатую систему, мембранный каркас на основе спектрина, актиновый цитоскелет, микротрубочки, и других элементов, таких как альфа-гранулы, плотные гранулы, пероксисомы, лизосомы и митохондрии. Плотная трубчатая система секвестрирует ионизированный кальций. Во время активации тромбоцитов запускается каскад реакций, приводящий к увеличению содержания цитозольного кальция, перестройке цитоскелета и высвобождению содержимого гранул тромбоцитов [2]. Происходят увеличение объема и изменение формы пластинок из дисковидной в сферическую с псевдоподиями.

Активность кровяных пластинок во многом определяется влиянием гуморальных факторов экзогенного и эндогенного происхождения. Так, гипоксия тканей и активация анаэробного метаболизма приводят к образованию большого количества лактата. Показано, что при уменьшении pH до 7,25 у кошек в сосудах наблюдаются агрегация форменных элементов крови, образование тромбов. Повреждение эндотелия, обусловленное увеличением количества внутриклеточной жидкости, стимулирует агрегацию тромбоцитов [3]. Согласно другим данным, молочная кислота увеличивает время свертывания крови и снижает агрегацию тромбоцитов [4]. При ишемии и инсульте в очагах их локализации и в крови всегда в больших количествах присутствует глутамат, являющийся одним из основных нейромедиаторов. Тромбоциты поглощают глутамат из плазмы через возбуждающие аминокислотные транспортеры и сохраняют его в плотных бета-гранулах. При активации тромбоцитов посредством экзоцитоза бета-гранул высвобождается большое количество глутамата, благодаря чему увеличиваются его локальные концентрации [5]. Показано, что предварительная обработка тромбоцитов глутаматом (100–1000 мкМ) стимулирует активацию тромбоцитов и высвобождение внутриклеточных везикул [6]. Вырабатываемый эндотелиальными клетками оксид азота (NO) не только расширяет кровеносные сосуды, но также ингибирует адгезию и агрегацию тромбоцитов. Образование оксида азота катализирует NO-синтаза. Сбой этого процесса может привести к нарушению продукции NO, последствиями чего могут явиться повышение тонуса сосудов и активация тромбоцитов, что способствует развитию атеросклероза и нарушению кровообращения [7]. Инкубация тромбоцитов с экзогенным донатором NO (нитропруссидом натрия) в концентрации 100 мкмоль/л приводит к уменьшению их агрегационной способности, морфологическим изменениям и снижению осмотической стойкости [8]. Актуальным является выявление закономерностей морфологической модификации тромбоцитов при действии гуморальных факторов, модулирующих уровень их функциональной активности, что позволит охарактеризовать особенности структурно-функциональных изменений кровяных пластинок под влиянием различных веществ и расширить представления о механизме гуморальной регуляции гемостаза.

Цель исследования: выявить особенности влияния, оказываемого снижением рН, вызванного введением лактата, оксида азота и глутамата натрия, на морфологические параметры тромбоцитов in vitro у крыс.

Материалы и методы исследования

В экспериментах in vitro было использовано 30 беспородных крыс-самцов массой 300–340 г. Все манипуляции проводились c соблюдением биоэтических принципов в соответствии с Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (European Convention for the Protection of Vertebral Animals Used for Experimental and Other Scientific Purposes. CETS No. 123, Страсбург, 1986 г.). Кровь брали под наркозом (1–2 мг золетила на 100 г массы) из левого желудочка сердца в вакутейнеры, содержащие цитрат натрия (3,8%) в соотношении 9:1. Эвтаназия осуществлялась посредством дислокации шейных позвонков, после чего проводился забор крови из левого желудочка. Для получения обогащенной тромбоцитами плазмы цитратную кровь центрифугировали 15 мин при 1500 об/мин (центрифуга Liston C 2204, Россия). Было проведено 3 серии экспериментов, позволяющих оценить особенности влияния лактата (n=7), нитропруссида натрия (НПН) в качестве экзогенного донатора оксида азота (n=14) и глутамата натрия на морфологические характеристики тромбоцитов (n=9). Для этого в каждой серии исследований тромбоцитарную плазму делили на 3 аликвоты (по 0,5 мл), в первую из которых в качестве контроля добавляли 0,1 мл физиологического раствора. В остальные пробирки добавляли либо раствор молочной кислоты на физиологическом растворе для получения pH 7,2 и 7,0, либо НПН в конечной концентрации в инкубационной среде 100 мкмоль/л и 1000 мкмоль/л, либо глутамат натрия в конечной концентрации 100 мкмоль/л и 1000 мкмоль/л. Все пробирки инкубировали 15 мин при температуре 37ºC (термостат ТВ-80-1, Россия), после чего готовили мазки тромбоцитарной плазмы и окрашивали их азур-2-эозином по Романовскому.

Морфологическое исследование проводилось с помощью компьютерной цитоморфометрии (программа анализа и обработки изображений GNU Image Manipulation Program, GIMP 2.10.14, США) на основе анализа микрофотографий, сделанных при использовании иммерсионного объектива (микроскоп Ломо Микмедво-1, Россия) и цифровой окулярной камеры. Измеряли такие морфометрические параметры, как большой и малый диаметры кровяной пластинки (длина и ширина соответственно), ее площадь и индекс элонгации (ИЭ). ИЭ = (L – W) / (L + W), где L – длина, W – ширина тромбоцита. Определяли процент тромбоцитов, содержащих в цитоплазме грануломер. Расчет производился на 500 клетках. В препаратах, окрашенных по Романовскому, гранулы тромбоцитов окрашиваются в красно-фиолетовый цвет. Соотношение выраженности синего и красного оттенков позволяет оценить степень зрелости кровяных пластинок. Преобладание в препарате цветов синего спектра отражает увеличение доли «молодых» пластинок. Большая выраженность красного цвета, напротив, свидетельствует о нарастании содержания «старых» тромбоцитов. Соотношение «молодых» и «старых» кровяных пластинок позволяет определить индекс омоложения тромбоцитов (ИОТр). Зеленая компонента цветового спектра отражает удельную оптическую плотность пластинок, определяемую степенью насыщения их гранулами, что, в свою очередь, характеризует уровень функциональной активности.

Вариационный анализ полученных результатов проводился в электронных таблицах Excel и программе Statistica с расчетом t-критерия Стьюдента, а также непараметрического критерия парных сравнений Вилкоксона. Нормальность распределения оценивалась на основании критерия Шапиро–Уилка. Данные представлены в виде средней арифметической и ошибки средней (M±m). Статистическая значимость различий соответствовала p≤0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Морфологический анализ мазков плазмы, обогащенной тромбоцитами, показал, что смещение pH среды в кислую сторону сопровождается удлинением кровяных пластинок (табл. 1).

Таблица 1

Морфологические параметры тромбоцитов

после инкубации с лактатом in vitro (M±m), n=7

Примечание: (здесь и далее)* – достоверные отличия по сравнению с контролем (p≤0,05).

Большой диаметр тромбоцитов, инкубированных с лактатом, возрастает как при pH 7,2 (p=0,005), так и при pH 7,0 (p<0,0008) по сравнению с контролем (pH 7,4). Уже при значении pH 7,2 наблюдается четкая тенденция к увеличению индекса элонгации (p=0,02), сохраняющаяся при pH 7,0 (p=0,0004). Возможно, при лактат-ацидозе происходит увеличение ионной проницаемости мембраны и концентрации цитозольного кальция, что способствует изменению ферментативной активности, белковой структуры цитоскелета и удлинению кровяных пластинок без увеличения их объема [9]. Однако количество тромбоцитов с грануломером по сравнению с контролем уменьшается при pH 7,2 (p=0,002) и при pH 7,0 (p=0,001), отражая уменьшение численности активных пластинок, что может быть связано с повреждающим влиянием высокой концентрации водородных ионов на мембрану тромбоцитов и с выбросом содержимого гранул в окружающее пространство.

Нитропруссид натрия, напротив, вызывает уменьшение морфологических параметров тромбоцитов in vitro, нарастающее при увеличении концентрации вещества в инкубационной среде, без изменения индекса элонгации (табл. 2).

Таблица 2

Морфологические параметры тромбоцитов после инкубации с нитропруссидом натрия in vitro (M±m), n=14

Так, большой диаметр кровяных пластинок статистически значимо уменьшатся после инкубации с 100 мкмоль/л и 1000 мкмоль/л раствора НПН (p=0,001 и p=0,01 соответственно). Максимальная концентрация донатора NO вызывает достоверное уменьшение малого диаметра и площади тромбоцитов по сравнению с контрольными значениями (p=0,0008 и p=0,0008 соответственно). При этом использование уже минимальной концентрации вещества сопровождается увеличением в препаратах доли оттенков красного спектра до 0,42±0,01 у.е. при 0,36±0,02 у.е. в контроле (p=0,006) и снижением ИОТр (p=0,002), что указывает на уменьшение количества «молодых», активных пластинок. Влияние раствора НПН в концентрации 1000 мкмоль/л проявляется снижением выраженности зеленого цвета в препарате до 0,38±0,01 у.е. по сравнению с контрольным показателем, равным 0,43±0,01 у.е., (p=0,01), и уменьшением количества тромбоцитов, содержащих грануломер (p=0,0001).

Эффект действия NO на тромбоциты связан с активацией гуанилатциклазы. Увеличение концентрации циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ), вызванное оксидом азота, тормозит освобождение арахидоновой кислоты, угнетая процесс активации фосфолипаз А2 и C, что предотвращает распад мембранных фосфолипидов. В результате ингибируются адгезия и агрегация тромбоцитов через торможение накопления свободного кальция в клетках. В условиях низкой активности фосфолипазы C нарушается образование инозитол-3-фосфата и диацилглицерола, которые являются специфическими вторичными посредниками, открывающими SMOC (вторично-управляемые каналы) и SOCC (депо-управляемые кальциевые каналы). Нарушения в работе этих каналов приводят к снижению притока кальция из внутриклеточных депо. Ионы кальция являются необходимым внутриклеточным регулятором. Нарастание концентрации этих ионов в цитоплазме играет ключевую роль в определении функциональной активности тромбоцитов, связанной с их агрегацией и реакцией высвобождения, а снижение – с дезагрегацией. Уменьшение содержания свободного кальция в тромбоцитах служит основной причиной нарушения процесса их активации. Кроме того, влияние метаболитов NO, инициирующих реакции свободнорадикального окисления, проявляется структурными преобразованиями мембраны кровяных пластинок (реорганизации актиновой сети и белков цитскелета), вероятно, приводящими к ее повреждению с последующим разрушением и появлением тромбоцитов меньших размеров [10].

Инкубация с глутаматом натрия в конечной концентрации 100 мкмоль/л и 1000 мкмоль/л сопровождается увеличением длины тромбоцитов по сравнению с контролем (p=0,02 и p=0,004 соответственно), их площади (p=0,05 и p=0,01 соответственно) и индекса элонгации (p=0,003 и p=0,03 соответственно) (табл. 3). Влияние глутамата на кровяные пластинки определяется взаимодействием его с глутаматными N-метил-d-аспартат (NMDA)-рецепторами [11]. Стимуляция глутаматных NMDA-рецепторов нарушает ионный гомеостаз, способствует проникновению в клетку катионов, таких как Na+ и Ca2+. Возникающая деполяризация клеточной мембраны приводит к открытию Ca2+-каналов, которые дополнительно увеличивают уровень внутриклеточного Ca2+. Увеличение цитозольного кальция стимулирует кальций-зависимые процессы, повышая активность различных ферментов, таких как протеинкиназы, фосфолипазы, протеазы, синтаза оксида азота, усиливается продукция арахидоновой кислоты, высокий уровень которой генерирует активные формы кислорода и азота. Образующийся пероксинитрит вызывает изменения структуры сократительных белков цитоплазматического матрикса и увеличение размеров тромбоцитов [9]. Нарастание концентрации ионов кальция в цитоплазме играет ключевую роль в активации тромбоцитов, связанной с их агрегацией и реакцией высвобождения [6].

Таблица 3

Морфологические параметры тромбоцитов после инкубации с глутаматом натрия in vitro (M±m), n=9

На фоне относительно стабильного ИОТр количество тромбоцитов, содержащих в цитоплазме грануломер, прогрессирующе снижается. При концентрации глутамата натрия 1000 мкмоль/л различие с контрольным показателем становится статистически значимым (p=0,03). Одновременно наблюдается уменьшение в препарате доли зеленого цвета до 0,39±0,01 у.е. по сравнению с контролем, составляющим 0,43±0,01 у.е. (p=0,01), что свидетельствует об уменьшении степени насыщения тромбоцитов гранулами, характеризующем снижение их функциональной активности. Возможно, это связано с завершившейся дегрануляцией активированных в присутствии глутамата пластинок и последующим уменьшением их функционального потенциала.

Таким образом, эффекты лактата, нитропруссида натрия и глутамата на морфологические параметры тромбоцитов отражают особенности изменения функциональной активности кровяных пластинок и проявляются изменением их площади, индекса элонгации, а также количества активных форм, что, вероятно, определяется характером влияния вещества на концентрацию внутриклеточного кальция.

Работа является частью комплексного исследования, выполняемого в соответствии с государственным заданием ФГБОУ ВО ИвГМА Минздрава России на 2021 год «Функциональный резерв гемостаза и реологии крови при гипоксических состояниях в норме и патологии».