Ревматоидный артрит относится к числу хронических системных аутоиммунных заболеваний, имеющих выраженную гендерную и возрастную структуру (отношение женщины: мужчины составляет 3:1 [1]; коэффициент детерминации (R2) в моделях «возраст – риск» 0,87–0,97 [2]). Заболевание характеризуется прогрессирующей инвалидностью и преждевременной смертностью. Проведение статистических исследований в глобальном масштабе позволило выявить, что по общему среднегодовому стандартизованному показателю заболеваемости РА имеет отчетливую тенденцию к росту: с 1990 по 2017 гг. на 7,4% [3].
Несмотря на высокие достижения современной фармакологии, лекарственных средств, излечивающих РА, к настоящему времени не существует и основное лечение базируется на использовании метотрексата и нестероидных противовоспалительных препаратов [4, 5], имеющих множество побочных эффектов. Поэтому ведутся активные исследования по поиску эффективных и безопасных средств адъювантной терапии, в числе которых находятся методы бальнеотерапии. Так, в работах отечественных исследователей [6, 7] отмечается, что после пребывания детей с ювенильным РА в условиях санаторно-курортного лечения, включающего использование лечебного фактора в виде хлоридных натриевых ванн, у пациентов выравниваются до нормы показатели клинико-лабораторных исследований, а сам подход может с успехом дополнять классические схемы лечения. В связи с этим представляется целесообразным научное обоснование терапевтического эффекта природной минеральной воды Тиб-1.
Цель работы – изучение корригирующего эффекта природной минеральной воды Тиб-1 в модели адъювант-индуцированного аутоиммунного ревматоидного артрита в эксперименте.
Материалы и методы исследования
В работе с лабораторными животными придерживались правил и этических норм содержания и ухода, описанных в руководстве National Research Council, 2011 г. и ГОСТ Р53434-2009 «Принципы надлежащей лабораторной практики» с разрешения этического комитета при Институте биомедицинских исследований РАН.
Эксперимент проводился на белых крысах линии Wistar (самцы с массой тела (м.т.) 400–440 г), разделенных на 3 равные группы по 8 животных в каждой. Первая группа – негативный контроль, животные получали растворители по схеме и в объемах, как у животных модельной и опытной групп. Вторая группа – с модельным аутоиммунным ревматоидным артритом, вызванным субкутанным введением полного адъюванта Фрейнда DIFCO LABORATORIES (Detroit, Michigan, США) из расчета 0,1 мл на 200 г массы тела в заднюю конечность животного. Третья группа – опытные животные с коррекцией РА (формируемого по той же схеме, что и во второй группе) природной минеральной водой Тиб-1, которую дегазировали, разводили дистиллированной водой в соотношении 1:3 (по объему) и заливали в поилку. Свободный доступ к воде у животных осуществлялся на протяжении первых 2 недель с момента индукции РА, после чего вода заменялась на обычную водопроводную и животные содержались еще в течение 5 недель на стандартном корме и в стандартных условиях вивария. Мониторинг объема выпитой минеральной воды показал, что животные употребляли в среднем в пересчете на неразбавленную Тиб-1 1,57 мл на 1 кг м.т.
Забор крови для клинико-лабораторных исследований осуществляли на 3-й и 7-й неделях, для чего животных усыпляли (внутрибрюшинное введение раствора золетила, Франция) и из сердца отбирали кровь. В стабилизированной антиокоагулянтом цельной крови определяли гематологические показатели на автоматическом анализаторе Mythic 22 (Польша). Лейкоцитарную формулу для большей точности подсчитывали микроскопией мазка. СОЭ определяли по Панченкову.
По окончании эксперимента животных усыпляли (СО2-затравочный бокс) и извлекали коленный сустав, который очищали от мышечных волокон и фиксировали нейтральным 10%-ным раствором формалина. Окраску срезов производили гематоксилин-эозином и анализировали при увеличении на микроскопе 10х10 и 10х40. Задние лапки фотографировали цифровой фотокамерой.
На основании полученных результатов рассчитывали среднее (M) и стандартную ошибку среднего (±m). Нормальность распределения случайных величин оценивали по W-критерию Шапиро–Уилка; в случае подтверждения нормальности выборки сравнение гипотез осуществлялось по t-критерию Стьюдента. В противном случае расчеты вели по U-критерию Манна–Уитни. Статистически значимыми различия считали при p<0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
Введение животным АФ, представляющего собой тип эмульсии «вода в масле», содержащей термически инактивированные M. tuberculosis, сопровождается выраженным иммунным ответом и увеличением лейкоцитов в крови (табл. 1).
Таблица 1
Лейкограмма и СОЭ экспериментальных животных с модельным аутоиммунным ревматоидным артритом
|
Анализируемый параметр |
Стат. показатели |
Нег. контроль |
Модель РА |
Модель РА+Тиб-1 |
|||
|
3 недели |
7 недель |
3 недели |
7 недель |
3 недели |
7 недель |
||
|
Лейкоциты, x109/л |
M±m |
15,78± 4,27 |
13,68± 0,86 |
26,12± 2,66** |
19,59± 1,40*** |
15,40± 1,18##U |
20,28± 2,33 |
|
П/я нейтрофилы, % |
M±m |
2,63± 0,73 |
1,50± 0,42 |
1,88± 0,46 |
0,75± 0,27 |
2,25± 0,45 |
2,13± 0,88 |
|
С/я нейтрофилы, % |
M±m |
21,63± 0,68 |
25,50± 1,38 |
26,00± 3,59 |
17,89± 1,84 |
37,25± 3,54#U |
26,63± 3,00 |
|
Эозинофилы, % |
M±m |
3,38± 1,29 |
3,38± 0,78 |
4,13± 1,53 |
3,13± 0,51 |
2,13± 0,61 |
2,13± 0,65 |
|
Лимфоциты, % |
M±m |
69,88± 3,81 |
66,75± 3,23 |
63,75± 3,36 |
76,25± 2,30 |
54,63± 3,17 |
65,00± 2,54# |
|
Моноциты, % |
M±m |
4,00± 1,12 |
5,38± 0,50 |
4,50± 0,68 |
2,00± 0,42**U |
3,75± 0,86 |
3,75± 0,56# |
|
СОЭ, мм/ч |
M±m |
1,50± 0,27 |
1,13± 0,13 |
1,13± 0,13 |
1,38± 0,18 |
1,00± 0,00 |
1,13± 0,13 |
*, ** – p<0,05 и 0,01, сравнение контрольных животных с модельными (3-я и 7-я неделя соответственно); #, ## – p<0,05 и 0,01, сравнение модельных животных с опытными (3-я и 7-я неделя соответственно); U – расчет р по критерию Манна–Уитни
Из таблицы 1 видно, что максимальной степени выраженности воспалительный процесс достигает к 3-й неделе после введения масляного адъюванта. Количество клеток белой крови у животных с РА по сравнению с негативным контролем статистически значимо повышается на 65%, выявляя острую фазу индуцированной патологии. К окончанию 7-й недели общее содержание лейкоцитов снижается, но по сравнению с контрольными цифрами остается повышенным на 43% (р<0,001). У животных, получавших минеральную воду в течение первых 2 недель с начала формирования модельной патологии, начало течения менее острое и содержание лейкоцитов относительно модельной группы оказывается сниженным на 41% (3-я неделя). К моменту завершения эксперимента различия в общей численности клеток белой крови нивелируются, и разница между сравниваемыми группами не превышает 3,5% (р=0,774).
Наиболее выраженными сдвигами в лейкоцитарной формуле являются относительные изменения в количестве нейтрофилов и, соответственно, лимфоцитов у животных с РА (табл. 1). Так, если у контрольных крыс вариативность численности нейтрофилов отмечается в пределах 17% (сравнение между 3-й и 7-й неделями), то на фоне сформированной патологии разброс значений оказывается шире: в модельной группе он составляет 45%, при профилактике минеральной водой – 39%. Введение индуктора воспалительного процесса приводит вначале к росту количества нейтрофилов (при сравнении с негативным контролем, 3-я неделя), после чего показатели снижаются до значений контрольной группы. Тем не менее, все отмеченные флуктуации находятся в пределах колебаний нормы.
Примечательным является то обстоятельство, что на фоне выраженного воспалительного процесса, фиксируемого ростом общей численности лейкоцитов, показатель СОЭ остается стабильным у животных модельной и опытной групп (табл. 1).
Другие исследуемые гематологические показатели белой крови колеблются незначительным образом, а выявленные межгрупповые отличия также не выходят за границы нормативных значений.
Развитию РА сопутствует субсиновиальный отек, оценка степени которого используется в качестве диагностического маркера течения заболевания в эксперименте. На рисунке 1 представлены фотографии задних конечностей крыс, полученные на завершающем этапе исследований.
Рис. 1. Фотографии задних лап экспериментальных крыс (7-я неделя): а – негативный контроль, б – модель РА, в – модель РА+Тиб-1
Из рисунка видно, что результатом системного воспалительного процесса, обусловленного введением АФ, является отечность конечностей (плюсны) у крыс с модельной патологией (рис. 1б). Двухнедельный курс приема минеральной воды способствует заметному купированию данного клинического признака РА, что проявилось уменьшением или полным нивелированием местных отеков (рис. 1в). Лапы контрольных животных – без патологических признаков отечности (рис. 1а).
Результаты гистологических исследований суставного аппарата представлены на рисунке 2.
Рис. 2. Морфология коленного сустава лабораторных животных: а – негативный контроль, б – модель РА, в – модель РА+Тиб-1 (верхний ряд увеличение 10х10, нижний ряд 10х40)
У всех животных модельной группы (рис. 2б) выявлены дегенеративные изменения сустава различной степени тяжести. Среди характерных признаков синовиальной оболочки следует отметить пролиферацию синовиоцитов, гиперплазию тканей, их отечность, очаги преимущественно лимфоцитарного периваскулярного инфильтрата. Для надхрящницы отмечены признаки дезорганизации соединительной ткани, проявляющиеся истончением и частичным разволокнением фиброзного слоя, а также относительным уменьшением клеточного состава камбиального слоя. Здесь также отмечается умеренно выраженный периваскулярный отек с инфильтрацией единичных лимфоцитов; присутствуют фокусы кровоизлияний. В единичных случаях отмечено истончение костной пластинки.
Для животных, получавших минеральную воду (рис. 2в), картина патологических изменений носит менее выраженный характер. Для тканей синовиальной оболочки также оказываются свойственными признаки гиперплазии и отечности. Покровный и коллагенно-эластический слои синовиальной мембраны в отдельных местах у некоторых животных сливаются вместе и истончаются. Хондроциты базальной и промежуточной зон имеют округлую форму, образуют изогенные группы и лежат в виде правильных вертикальных рядов. Хондроциты, расположенные в поверхностной зоне, имеют веретенообразную форму и чаще не образуют групп. Признаки разволокнения и истончения внешних слоев перихондрия выражены в меньшей степени в сравнении с животными модельной группы.
Гистоархитектоника соединительной ткани у животных контрольной группы (рис. 3а) – без видимых признаков патологических изменений.
Начиная с 1950-х гг. адъюванты Фрейнда (полный и неполный) являются незаменимыми во многих протоколах испытаний, предполагающих моделирование патологий иммунной системы [8]. Эффект от введения АФ зависит от вида экспериментальных животных и может иметь орган-специфическую направленность [9, 10].
Результатом иммунизации являются высокий уровень циркулирующих антиген-специфических антител, активация Т-лимфоцитов с развитием гиперчувствительности замедленного типа. Следующий за этим сбой иммунной толерантности сопровождается воспалительным процессом, который приводит к развитию аутоиммунного артрита.
На фоне индуцированной патологии комплекс гематологических, клинических и гистологических исследований свидетельствует о модифицирующем действии природной минеральной воды Тиб-1 в отношении наиболее характерных признаков заболевания. Так, снижение воспалительного процесса, особенно проявляющееся в острой фазе (3-я неделя), может быть обусловлено повышением адаптивных резервов организма за счет восстановления баланса между процессами перекисного окисления липидов и антиоксидантной системой, активации детоксикационной и выводящей систем, что было выявлено авторами исследования [11] в условиях экспериментальной патологии органов пищеварения в отношении минеральной воды схожего с Тиб-1 химического состава.
В патенте [12] лечение заболеваний опорно-двигательной системы достигается за счет использования бальнеологических процедур, включающих применение пенно-минерально-вихревых ванн из сульфатно-хлоридных натриевых природно-минеральных вод. Как отмечают авторы, лечебный эффект достигается за счет транскутанной резорбции микроэлементов, входящих в состав минеральной воды и способствующих нормализации обменных процессов в организме, ускорению процессов репарации, иммуномодуляции и нормализации гормонального фона. Пользуясь общепринятым в курортологии и фармакологии принципом «по аналогии», логично предположить, что восстановительный эффект исследуемой природной воды может быть обусловлен биологическими свойствами микроэлементов, в первую очередь – кальция, играющего ключевую роль в обменных, энергетических и пластических процессах организма и костно-мышечной системы в частности.
Заключение
Введение животным питьевой лечебно-столовой минеральной воды Тиб-1 сопровождается снижением генерализованного воспалительного процесса, сохранением гистоархитектоники суставного хряща, субхондральной кости и снижением степени дистрофических изменений суставного аппарата по сравнению с животными с модельной патологией аутоиммунного ревматоидного артрита, что обосновывает целесообразность использования бальнеологического подхода в качестве эффективного вспомогательного метода при лечении и профилактике заболеваний соединительной ткани.