В последние годы активно изучаются количественный состав и функциональная активность микробиома человека в норме и при патологических процессах разной этиологии [1–3].
Выявлено [4], что в гастробиоптатах здоровых лиц Helicobacter (H.) pylori является наиболее распространенным представителем, за которым следуют виды, обычно встречающиеся в биотопах полости рта, при этом наблюдаются сходство в таксономических профилях и различия в функциональных. Ранее двумя основными родами, обнаруженными в желудке, считались бактерии родов Streptococcus и Prevotella [5].
Результаты исследований роли изменений микробиоты в канцерогенезе желудка достаточно противоречивы [3, 4, 6]. Обнаружено [4], что содержание H. pylori значимо выше в незлокачественных, чем в опухолевых тканях желудка. Исследование пациентов с хроническим гастритом и пациентов с гастрокарциномой с помощью количественной полимеразной цепной реакции [7] показало, что бактериальная нагрузка на слизистую оболочку желудка (СОЖ) превалировала при опухолевом процессе и положительно коррелировала с количеством H. pylori.
Установлено [6], что присутствие H. pylori в СОЖ прямо не влияет на биоразнообразие желудочной микробиоты, тогда как индуцированная H. pylori атрофия желудочных желез приводит к гипохлоргидрии и колонизации бактериями, грибами СОЖ, усиливая выработку канцерогенных N-нитрозосоединений и мутагенез эпителия [4, 6, 8]. Выявлено [9], что индекс микробного дисбиоза положительно коррелировал с видами рода Helicobacter.
В определенных условиях резидентные микроорганизмы могут вызывать воспаление, увеличение пролиферации клеток, изменение динамики стволовых клеток и, в итоге, нарушение целостности ДНК и иммунной регуляции, способствуя канцерогенезу [8]. Так, ранее при атрофическом гастрите и раке желудка была обнаружена прямая взаимосвязь (p<0,01) титров суммарных антител (САТ) к CagA H. pylori и сывороточного уровня интерлейкина-17 [10], моноцитарного хемоаттрактантного протеина-1 [11] с превышением дискриминационного уровня иммунорегуляторными пептидами.
Цель исследования: изучить патогенетические изменения пристеночной микробиоты желудка при стадировании рака желудка.
Материал и методы исследования. При письменном согласии на участие в исследовании проведено комплексное обследование больных раком желудка – пациентов Мордовского республиканского онкологического диспансера, Онкологического диспансера № 4 г. Москвы, больных с обострением атрофического гастрита – пациентов поликлиники № 4 г. Саранска, городской поликлиники № 3 г. Москвы. Для корректного статистического анализа обследуемые пациенты были распределены в равнозначные по численности (n=30) группы сравнения: 1-я группа – больные с обострением атрофического гастрита, 2-я группа – онкобольные со II стадией рака желудка, 3-я группа – больные раком желудка III стадии, 4-я группа – больные раком желудка IV стадии. 30 клинически здоровых лиц без признаков онкозаболевания и обострения гастропатологии на момент обследования составили контрольную (0-ю) группу.
В группах обследованных лиц значимых гендерно-возрастных различий не наблюдалось.
Прием антибактериальных препаратов в течение предшествующих 6 месяцев являлся критерием невключения в исследование.
Диагностику инфекции H. pylori осуществляли с помощью инвазивных (ХЕЛПИЛ-тест (ООО «Ассоциация Медицины и Аналитики», Россия), цитологическое исследование мазков-отпечатков биоптатов, микробиологическое, гистологическое исследование биоптатов) и неинвазивных (ХЕЛИК-тест (ООО «Ассоциация Медицины и Аналитики», Россия), иммуноферментный анализ титра суммарных антител (IgG+IgM+IgA) к CagA H. pylori) методов.
Эзофагогастродуоденоскопия (ЭГДС) с забором биоптатов с пристеночной слизью проводилась у здоровых добровольцев в условиях поликлиник, у больных – при поступлении на амбулаторное или стационарное лечение.
При цитологическом и гистологическом исследовании препаратов оценивали наличие и степень обсемененности хеликобактериями: слабая, средняя, высокая с количеством микроорганизмов до 20, до 50 и больше 50 в поле зрения соответственно.
Мукозную микробиоту изучали микроскопическим и микробиологическим методами. Для культивирования использовали питательные среды производства ФБУН ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии (Россия), «HiMedia Laboratories Pvt Ltd» (Индия): геликобактерный, желточно-солевой, кровяной агары, среды Китта–Тароцци, МРС, Сабуро, тиогликолевую, Эндо. Подсчитывали численность микроорганизмов по колониеобразующим единицам в 1 г материала (КОЕ/г) с учетом массы исследуемого материала и разведения. Диагностически значимым служил титр 103 КОЕ/г.
Титр САТ к CagA H. pylori в сыворотке крови оценивали иммуноферментным методом, используя тест-системы ЗАО «Вектор-Бест» (Россия).
При статистической обработке данных использовали подсчет медианы (Ме), критерий Стьюдента, корреляционный анализ с расчетом коэффициента Спирмена (rs).
Результаты исследования и их обсуждение. Микроскопия мазков-отпечатков гастробиоптатов выявила наличие хеликобактерий как в контрольной группе, так и в группах сравнения, клетки дрожжеподобных грибов определялись только у обследованных пациентов. Результаты совпали с данными ХЕЛИК- и ХЕЛПИЛ-тестов. Среди больных раком желудка при нарастании опухолевого процесса степень обсемененности хеликобактериями снижалась, дрожжеподобными грибами – повышалась (табл. 1).
Таблица 1
Выявляемость хеликобактерий и дрожжеподобных грибов при микроскопии гастробиоптатов (абс.; %)
|
Показатель |
0-я группа |
1-я группа |
2-я группа |
3-я группа |
4-я группа |
|
|
Степень обсемененности хеликобактериями |
слабая |
10; 33,33% |
10; 33,33% |
10; 33,33% |
11; 36,67% |
12; 40% |
|
средняя |
2; 6,67% |
5; 16,67% |
9; 30% |
7; 23,33% |
6; 20% |
|
|
высокая |
0; 0% |
3; 10% |
2; 6,67% |
1; 3,33% |
0; 0% |
|
|
Дрожжеподобные грибы |
0; 0% |
5; 16,67% |
5; 16,67% |
6; 20% |
8; 26,67% |
|
При бактериологическом исследовании клинически здоровых добровольцев наиболее часто выделялись Lactobacillus species (spp.), Streptococcus spp., H. pylori, Prevotella spp., Escherichia (E.) coli, Staphylococcus (S.) epidermidis. Реже всего высевались Actinomyces spp., Candida spp., Neisseria spp., S. aureus.
В 1-й группе у >66% больных выделялись Streptococcus spp., у 60% – H. pylori, у 50% – Candida spp., S. epidermidis, наблюдалось девятикратное увеличение встречаемости S. aureus относительно контрольной группы. Наименьшая частота высеваемости отмечалась у Actinomyces spp., Corynebacterium spp., Micrococcus spp., Neisseria spp.
Во 2-й группе у 70% больных культивировались H. pylori, у >63% – Streptococcus spp., у >46% – S. epidermidis, у >43% – Candida spp. На II стадии рака желудка относительно клинически здоровых лиц отмечалось увеличение встречаемости S. aureus в 8 раз, Candida spp. – в 4 раза.
В 3-й группе, так же как в группах сравнения, наиболее часто выделялись Streptococcus spp. (у >76% больных), H. pylori (у >63%), S. epidermidis (у >56%), Candida spp. (>46%). На III стадии опухолевого процесса относительно здоровых лиц отмечались увеличение высеваемости Actinomyces spp., E. coli, Micrococcus spp., Neisseria spp., Prevotella spp., S. aureus, Veilonella spp. в комбинациях с перечисленными ранее микроорганизмами, уменьшение встречаемости Lactobacillus spp.
В 4-й группе у 25 (83,33%) больных с IV стадией рака желудка выделялись Streptococcus spp., у 20 (66,67%) – S. epidermidis, у 18 (60%) – H. pylori, у 16 (53,33%) – Candida spp., у 14 (46,67%) – E. coli, Veilonella spp.; относительно клинически здоровых лиц наблюдалось увеличение высеваемости бактерий родов Actinomyces, Micrococcus, Neisseria, Prevotella spp., S. aureus, уменьшение встречаемости Lactobacillus spp., Corynebacterium spp., прогрессирующих с опухолевым ростом (табл. 2).
Таблица 2
Микробный пейзаж пристеночной слизи гастробиоптатов обследованных лиц: частота высеваемости (абс.; %)
|
Микроорганизмы |
0-я группа |
1-я группа |
2-я группа |
3-я группа |
4-я группа |
|
Actinomyces |
2; 6,67% |
3; 10% |
4; 13,33% |
5; 16,67% |
6; 20% |
|
Candida |
3; 10% |
15; 50% |
13; 43,33% |
14; 46,67% |
16; 53,33% |
|
Corynebacterium |
6; 20% |
3; 10% |
5; 16,67% |
5; 16,67% |
4; 13,33% |
|
Escherichia coli |
9; 30% |
10; 33,33% |
12; 40% |
13; 43,33% |
14; 46,67% |
|
Helicobacter pylori |
12; 40% |
18; 60% |
21; 70% |
19; 63,33% |
18; 60% |
|
Lactobacillus |
14; 46,67% |
10; 33,33% |
11; 36,67% |
9; 30% |
7; 23,33% |
|
Micrococcus |
4; 13,33% |
3; 10% |
5; 16,67% |
7; 23,33% |
9; 30% |
|
Neisseria |
2; 6,67% |
3; 10% |
4; 13,33% |
5; 16,67% |
6; 20% |
|
Prevotella |
10; 33,33% |
12; 40% |
10; 33,33% |
12; 40% |
13; 43,33% |
|
Staphylococcus aureus |
1; 3,33% |
9; 30% |
8; 26,67% |
10; 33,33% |
12; 40% |
|
Staphylococcus epidermidis |
8; 26,67% |
15; 50% |
14; 46,67% |
17; 56,67% |
20; 66,67% |
|
Streptococcus |
13; 43,33% |
20; 66,67% |
19; 63,33% |
23; 76,67% |
25; 83,33% |
|
Veilonella |
4; 13,33% |
9; 30% |
11; 36,67% |
12; 40% |
14; 46,67% |
Полученные результаты демонстрируют увеличение частоты высеваемости представителей мукозальной микробиоты желудка при распространенном атрофическом и опухолевом процессах относительно здоровых лиц. Прогрессирование опухолевого процесса сочеталось с усилением дисбиоза гастродуоденальной зоны: ростом обсемененности СОЖ Actinomyces spp., Candida spp., E. coli, Micrococcus, Neisseria, Prevotella spp., S. aureus, S. epidermidis, Streptococcus spp., Veilonella spp., уменьшением встречаемости Lactobacillus spp., Corynebacterium spp. Следует отметить, что высеваемость H. pylori падала при увеличении стадии рака желудка, но превалировала относительно здоровых лиц на 30–20%.
В контрольной группе наибольшая численность определялась у Streptococcus spp., H. pylori, E. coli, Lactobacillus spp. В меньших количествах высевались Corynebacterium spp., S. epidermidis – 3,08‑3,60 lg КОЕ/г, Prevotella spp. – 3,08‑3,30 lg КОЕ/г. Численность Candida spp. не превышала 3,11 lg КОЕ/г.
В 1-й группе наибольшая численность (4,08–5,20 lg КОЕ/г) определялась у H. pylori, Streptococcus spp. У 15 (50%) больных количество Candida spp. достигало 3,48–4,24 lg КОЕ/г, S. epidermidis – 3,48–4,30 lg КОЕ/г. У 9 (30%) пациентов с обострением атрофического гастрита отмечалось значимое увеличение численности S. aureus и Veilonella spp. – 2,95–3,70 lg КОЕ/г относительно здоровых лиц. При сравнении с контрольной группой у больных наблюдалось уменьшение количества Corynebacterium spp., E. coli, Lactobacillus spp.
Во 2-й группе доминировала численность H. pylori (4,30–5,41 lg КОЕ/г), Streptococcus spp. (3,60–4,48 lg КОЕ/г), S. epidermidis (3,30–4,11 lg КОЕ/г), Candida spp. (3,11–3,95 lg КОЕ/г). При сравнении со здоровыми добровольцами на II стадии рака желудка количественный уровень Actinomyces spp., Neisseria spp., S. aureus, Veilonella spp. увеличивался, E. coli, Lactobacillus spp. – уменьшался.
В 3-й группе превалировала численность H. pylori (4,30–5,30 lg КОЕ/г), Streptococcus spp. (3,78–4,60 lg КОЕ/г), S. epidermidis (3,60–4,48 lg КОЕ/г), Candida spp. (3,24–3,95 lg КОЕ/г). На III стадии рака желудка у больных количество Actinomyces spp., Micrococcus spp., Neisseria spp., S. aureus, Prevotella spp., Veilonella spp. повышалось относительно здоровых лиц, E. coli, Lactobacillus spp. – уменьшалось.
В 4-й группе у больных лидирующую позицию заняла численность Streptococcus spp. (4,08–5,0 lg КОЕ/г). Количество H. pylori (4,204–5,30 lg КОЕ/г), S. epidermidis (3,60–4,60 lg КОЕ/г), Candida spp. (3,85–4,48 lg КОЕ/г) превышало аналогичные показатели СОЖ здоровых лиц. На IV стадии рака желудка у больных количество Actinomyces spp., Micrococcus spp., Neisseria spp., S. aureus, Prevotella spp., Veilonella spp. было выше, чем в контрольной группе, численность Lactobacillus spp. ниже (табл. 3).
Таблица 3
Количество (lg КОЕ/г) микроорганизмов в пристеночной слизи гастробиоптатов обследованных лиц (Mе [min; max])
|
Микроорганизмы |
0-я группа |
1-я группа |
2-я группа |
3-я группа |
4-я группа |
|
Actinomyces |
0 [0; 2,48] |
0 [0; 3,60] |
1,45 [0; 3,48] |
1,56 [0; 3,48] |
1,65 [0; 3,6]*∆ |
|
Candida |
0 [0; 3,11] |
1,74 [0; 4,24]* |
1,56 [0; 3,95]* |
1,65 [0; 3,95]* |
2,12 [0; 4,48]* |
|
Corynebacterium |
1,65 [0; 3,60] |
0 [0; 3,48] |
1,80 [0; 4,30] |
1,74 [0; 4,11] |
1,65 [0; 3,48] |
|
E. coli |
1,98 [0; 4,24] |
1,54 [0; 3,48] |
1,62 [0; 3,70] |
1,74 [0; 3,78] |
1,89 [0; 4,08]∆ |
|
H. pylori |
1,92 [0; 4,48] |
4,3 [0; 5,20]* |
4,73 [0; 5,41]* |
4,39 [0; 5,30]* |
4,25 [0; 4,95]* |
|
Lactobacillus |
1,98 [0; 4,11] |
1,45 [0; 3,24]* |
1,65 [0; 3,60] |
1,56 [0; 3,48]* |
1,39 [0; 3,08]* |
|
Micrococcus |
0 [0; 2,85] |
0 [0; 3,24] |
1,48 [0; 3,11] |
1,59 [0; 3,3]*∆ |
1,74 [0; 3,6]*∆ |
|
Neisseria |
0 [0; 2,78] |
0 [0; 3,70] |
1,62 [0; 3,48] |
1,74 [0; 3,60]* |
1,80 [0; 3,78]* |
|
Prevotella |
1,59 [0; 3,30] |
1,80 [0; 3,78] |
1,74 [0; 3,60] |
1,85 [0; 3,90] |
1,98 [0; 4,11] |
|
S. aureus |
0 [0; 2,30] |
1,65 [0; 3,70]* |
1,56 [0; 3,41]* |
1,80 [0; 3,78]* |
1,89 [0; 3,90]* |
|
S. epidermidis |
1,54 [0; 3,60] |
3,54 [0; 4,3]* |
3,39 [0; 4,11]* |
3,65 [0; 4,48]* |
3,85 [0; 4,60]* |
|
Streptococcus |
1,98 [0; 4,60] |
4,18 [0; 4,78]* |
3,84 [0; 4,48] |
4,11 [0; 4,60]* |
4,3 [0; 5,0]*Ƥ |
|
Veilonella |
0 [0; 2,48] |
1,80 [0; 3,60]* |
1,65 [0; 3,48]* |
1,74 [0; 3,60]* |
1,85 [0; 3,78]* |
Примечание: min – минимальное значение, max – максимальное значение, * – отличия от контрольной группы, ∆ – отличия от 1-й группы, § – отличия от 2-й группы.
При корреляционном анализе изменений численности H. pylori и других представителей мукозной микробиоты желудка выявили ряд прямых и обратных взаимосвязей показателей (табл. 4).
Таблица 4
Корреляция представителей мукозной микробиоты желудка (rs)
|
Микроорганизмы |
H. pylori |
||||
|
0-я группа |
1-я группа |
2-я группа |
3-я группа |
4-я группа |
|
|
Actinomyces |
0,097 |
0,224 |
0,371* |
0,275 |
0,102 |
|
Candida |
0,025 |
0,121 |
0,176 |
0,151 |
0,230 |
|
Corynebacterium |
0,620** |
0,348 |
0,359* |
0,317 |
0,477** |
|
E. coli |
0,547** |
0,518** |
0,409* |
0,506** |
0,591** |
|
Lactobacillus |
0,777** |
0,300 |
0,289 |
0,297 |
0,310 |
|
Micrococcus |
–0,315 |
–0,405* |
–0,471** |
–0,536** |
–0,379* |
|
Neisseria |
0,215 |
0,264 |
0,243 |
0,145 |
0,170 |
|
Prevotella |
0,136 |
0,155 |
0,227 |
0,360* |
0,362* |
|
S. aureus |
0,330 |
0,569** |
0,590** |
0,595** |
0,654** |
|
S. epidermidis |
0,771** |
0,311 |
0,364* |
0,493** |
0,420* |
|
Streptococcus |
0,773** |
0,277 |
0,167 |
0,188 |
0,547** |
|
Veilonella |
0,085 |
0,152 |
0,162 |
0,254 |
0,288 |
Примечание: * – уровень статистической значимости (р) ≤0,05, ** – р≤0,01.
Заключение. Таким образом, у больных раком желудка при сравнении с клинически здоровыми добровольцами отмечаются изменения мукозной микробиоты: повышение высеваемости и количества Actinomyces spp., Candida spp., H. pylori, Micrococcus spp., Neisseria spp., Prevotella spp., S. aureus, S. epidermidis, Streptococcus spp., Veilonella spp., снижение встречаемости и численности Lactobacillus spp. Контаминация СОЖ коринебактериями на II–III стадиях рака желудка увеличивалась, на IV стадии опухолевого процесса и при атрофическом гастрите – уменьшалась. Выявленная общность может определяться схожестью морфофункциональных изменений. Прогрессирование опухолевого процесса сопровождалось ростом высеваемости и снижением количества E. coli без достижения уровня здоровых лиц.
Контаминация неизмененной СОЖ H. pylori была сильно взаимосвязана с численностью Lactobacillus spp., Streptococcus spp., S. epidermidis, при атрофическом гастрите обнаружены положительные корреляционные связи средней силы с количеством E. coli, S. aureus, умеренная отрицательная связь с Micrococcus spp. При прогрессировании рака желудка нарастала сила прямой взаимосвязи численности H. pylori и S. aureus, E. coli, S. epidermidis, Streptococcus spp., Prevotella spp.
Исследование микробного пейзажа пристеночной слизи гастробиоптатов при обострении хронического атрофического гастрита, раке желудка следует использовать для решения о проведении персонализированной селективной деконтаминации.