Гемобластозы, являющиеся опухолями органов кроветворения, относятся к самым распространенным формам злокачественных новообразований среди детей. Такие патологии составляют около 50% всех случаев онкологических заболеваний детского возраста, большая часть из которых представлена острыми лимфобластными лейкозами (ОЛЛ) (80–90%) [1]. В связи с высокой гетерогенностью данной онкопатологии большую роль в диагностике, классификации и прогнозе течения заболевания играет выявление молекулярно-генетических аномалий у больных. Известно, что в 80% случаев развитие как острых лимфобластных, так и острых миелобластных лейкозов ассоциировано с различными хромосомными аномалиями, причем для ОЛЛ часто отмечаются различия в аберрациях у детей разных возрастных групп [2]. Исследователи в основном выделяют две группы пациентов по хромосомным аномалиям: дети первого года жизни и дети старшего возраста (1–17 лет с пиком заболеваемости 2–5 лет). При этом у больных младше 1 года наиболее распространенными являются перестройки гена MLL с преобладанием 11q23/MLL [3], в то время как пациенты старшей возрастной группы характеризуются большим диапазоном изменений, из которых особенно часто встречаются t(12;21) и t(1;19), приводящие к образованию химерных транскриптов ETV6/RUNX1 и TCF3/PBX1 соответственно [2, 4]. Также нередко среди больных детей отмечается гипердиплоидия с увеличением количества 4, 6, 10, 14, 17, 20 и X-хромосом [4, 5].
Для выявления генетических изменений, как правило, используются данные стандартного кариотипирования, флуоресцентной гибридизации in situ (FISH), варианты полимеразной цепной реакции, а также различные сочетания данных методов [3, 6].
Стоит отметить, что чувствительность методов в выявлении аномалий значительно различается. Так, наименьшей чувствительностью характеризуется стандартный метод кариотипирования (59,8% выявляемости структурных перестроек MLL), а наибольшей – FISH-исследование (73,1% выявляемости структурных перестроек MLL) [3]. Метод полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) имеет наибольшую диагностическую значимость при острых миелобластных лейкозах (ОМЛ). Данная модификация ПЦР необходима для выявления транслокаций, участвующих в репрессии комплекса CBF, активации тирозинкиназ и их рецепторов. Кроме того, ОТ-ПЦР, согласно мнению ряда авторов, служит единственным способом идентификации трисомии 11 хромосомы при ОМЛ, а также мутаций RUNX1 [7]. При ОЛЛ ПЦР с обратной транскрипцией может использоваться наряду с FISH-исследованием для диагностики t(9;22) типа p190, а также образования химерных транскриптов ETV6/RUNX1, E2A/PBX1, SIL-TAL1 и некоторых других [8].
В связи с особой значимостью молекулярно-генетических перестроек при острых лимфобластных лейкозах и сложностями их диагностики изучение особенностей выявления хромосомных аберраций различными методами представляется актуальным.
Цель исследования: изучить особенности выявления молекулярно-генетических перестроек у детей с острыми лимфобластными лейкозами с помощью различных методов для оценки их эффективности.
Материал и методы исследования. В ходе исследования провели ретроспективный анализ 155 историй болезни детей с первичными острыми лимфобластными лейкозами в возрасте от 6 месяцев до 17 лет, находившихся в гематологическом отделении ГБУЗ «Детская краевая клиническая больница» МЗ КК г. Краснодара в период 2016–2020 гг.
В соответствии с иммунофенотипом (по классификации EGIL) дети были распределены в две группы исследования: первую группу составили больные В-ОЛЛ (n=139), вторую – Т-ОЛЛ (n=16) (табл. 1).
Таблица 1
Характеристика контингента исследования
|
Пол |
Тип ОЛЛ (n=155) |
|
|
В-ОЛЛ, n=139 |
Т-ОЛЛ, n=16 |
|
|
Ж |
68 |
5 |
|
М |
71 |
11 |
|
Возраст (Me(25–75‰) |
||
|
Ж |
4,0 (2,0–7,0) |
7,0 (6,5–7,5) |
|
М |
3,8 (2,0–6,3) |
6,5 (5,0–7,3) |
Соотношение мальчиков и девочек в группе больных В-клеточным ОЛЛ составило 1,04:1, среди больных Т-ОЛЛ – 2,2:1. Медиана возраста у больных В-ОЛЛ составила 4,0 (девочки) и 3,8 года (мальчики), у детей с Т-ОЛЛ – 7,0 и 6,5 года соответственно.
Характер молекулярно-генетических перестроек оценивали по результатам стандартного кариотипирования и флуоресцентной гибридизации in situ (FISH). При этом стандартный цитогенетический анализ проводился с использованием дифференциального окрашивания хромосом с последующим кариотипированием в соответствии с международной номенклатурой хромосом человека. Флуоресцентная гибридизация in situ осуществлялась в присутствии ДНК-зондов Kreatech, CytoTest, MetaSystems к наиболее значимым транслокациям в соответствии с иммунологическим типом ОЛЛ.
Статистический анализ полученных данных производили в программе IBM SPSS Statistics 22.0. Количественные переменные вследствие их несоответствия закону нормального распределения оценивали с помощью критерия Манна–Уитни, категориальные переменные – с помощью критерия Пирсона χ2 с уровнем значимости при p≤0,05.
Результаты исследования и их обсуждение. В ходе исследования больным детям были проведены стандартное кариотипирование и FISH-исследование в 100% случаев (155 детей). При этом генетические аномалии были обнаружены в 52,2% случаев при FISH-исследовании и в 39,4% случаев при стандартном кариотипировании (χ2=6,277, p≤0,05). Нормальный кариотип без транслокаций при FISH-исследовании встречался среди детей значительно реже (9,7% больных), при этом у 59 детей (38,1%) при проведении стандартного кариотипирования не наблюдалось митозов (табл. 2).
Подобное соотношение выявляемости аномалий с помощью стандартного кариотипирования и гибридизации in situ, согласно А.В. Мисюрину [2017] и другим авторам, может быть обусловлено субмикроскопическим характером хромосомных аномалий, а также особенностями деления некоторых опухолевых клонов [6, 9]. Так, t(12;21)/ETV/RUNX1, химерный транскрипт SIL-TAL1 и некоторые перестройки гена MLL носят криптический характер, в связи с чем не могут быть определены при стандартном кариотипировании, а гипердиплоидные лейкозные клетки характеризуются низкой митотической активностью при культивировании, что также затрудняет процесс цитогенетического исследования [6, 10].
Таблица 2
Результаты молекулярно-генетических исследований
|
Тип исследования |
Аномальный кариотип |
Нормальный кариотип |
||
|
B-ОЛЛ, количество детей |
Т-ОЛЛ, количество детей |
B-ОЛЛ, количество детей |
Т-ОЛЛ, количество детей |
|
|
Стандартное кариотипирование |
55 |
6 |
31 |
4 |
|
FISH |
73 |
8 |
66 |
8 |
Примечание: в таблице 2 не учтены данные о пациентах, в материале которых в ходе цитогенетического исследования не было обнаружено митозов (59 детей).
По итогам цитогенетического исследования детей обеих групп наиболее распространенными аномалиями стали: t(12;21)/ETV/RUNX1, диагностируемая в 22,6% случаев, гипердиплоидный клон с трисомией 4, 10, 17 хромосом, обнаруженный у 12,9% детей, а также перестройки генов TCF3/PBX1 и MLL у 5,1% и 3,9% больных соответственно. Причем среди генов-партнеров MLL отмечены ENL (В-ОЛЛ) и AF6 (Т-ОЛЛ). Гиподиплоидный клон с количеством хромосом 45-47 был отмечен у 4 детей и в 3 случаях сопровождался t(12;21), в 1 случае – перестройкой Т-клеточного рецептора. Остальные транслокации встречались единично и были представлены t(9;22), t(8;14), перестройками генов SIL-TAL1, CRLF2, IGH, TCR и TLX3.
Полученным результатам FISH-исследования соответствовали различные итоги стандартного кариотипирования. Так, наряду с наиболее распространенной t(12;21)/ETV/RUNX1, носящей криптический характер, цитогенетическим методом были выявлены: дериватная 12 хромосома (3 случая), дополнительные +X, +5, +8, +10, +21 (3 случая), делеции 12p (1 случай). При выявлении трисомии по 4, 10, 17 хромосомам в цитогенетических данных отмечали добавочные +8, +14, +16, +18, +21, +X, а также определялись дупликации (dup (1)), дериватные и маркерные хромосомы (der (1); mar).
Подобные результаты согласуются с мнением ряда исследователей. На самом деле криптические перестройки в виде t(12;21) с образованием химерного онкогена ETV/RUNX1 выявляются у детей в 25% случаев, сопряжены с возрастом больных и характеризуются благоприятным прогнозом [6]. Так, в исследовании Г.А. Цаура и соавт. [2016] среди 172 детей первого года жизни больных с t(12;21) не было обнаружено, в то время как в исследовании Ж.В. Пермикина и соавт. [2018] данная аномалия диагностировалась в 22,4% случаев у детей старшего возраста [10]. Выявленные нами цитогенетические нарушения тоже часто отмечаются авторами и, как правило, ассоциированы с делецией 12p [6, 11].
Более распространенной аномалией среди детей разного возраста является наличие гипердиплоидного клона с количеством хромосом более 51. Причем подобные перестройки часто связаны с трисомией 4, 10, 17, 18 хромосом и характеризуются наиболее высокими показателями пятилетней бессобытийной выживаемости [12]. Однако существуют случаи гиподиплоидии под «маской» гипердиплоидии [13]. О подобных случаях сообщают в своем исследовании A. Carroll et al. [2019]. Согласно авторам, у некоторых больных в результате удвоения гиподиплоидного клона наблюдается эффект «маскировки» истинной плоидности клона, что приводит к диагностированию данного типа лейкоза как гипердиплоидного. По сравнению с благоприятным прогнозом при гипердиплоидном лейкозе гиподиплоидия характеризуется крайне плохим прогнозом основного заболевания, в связи с чем корректная диагностика данной генетической аномалии становится особенно важной. По мнению A. Carroll et al. [2019], в половине случаев «замаскированной» гиподиплоидии в FISH-исследовании выявляется небольшая популяция гиподиплоидных клеток, однако примерно у 57% больных признаки гиподиплоидного клона удается обнаружить лишь с помощью анализа микросателлитных панелей [13].
Самыми часто обнаруживаемыми генетическими аномалиями при ОЛЛ авторы считают перестройки в гене MLL, выявляемые в 70% случаев острых лимфобластных лейкозов, которые в зависимости от гена-партнера могут служить как благоприятными, так и неблагоприятными прогностическими факторами [14, 15]. Обнаруженные в нашем исследовании химерные транскрипты MLL составляют, однако, лишь 3,9% и являются довольно редкими аномалиями при ОЛЛ, по мнению ряда авторов [6]. При этом реорганизация MLL-ENL, выявленная у больного с В-ОЛЛ, характеризуется наихудшим прогнозом по сравнению с MLL-AF6 у пациента с Т-ОЛЛ [6]. Таким образом, тенденция большого количества больных с перестройками MLL в нашем исследовании не прослеживается, что может быть обусловлено старшим возрастом детей, а также особенностями используемых для диагностики методов [3].
При анализе полученных данных о молекулярно-генетических перестройках было обнаружено 44 случая несоответствия стандартного кариотипирования результатам FISH-исследования (табл. 3).
Таблица 3
Расхождения в результатах молекулярно-генетических и цитогенетических методов
|
Тип ОЛЛ |
Пол |
Возраст, лет (Me) |
Результаты цитогенетики |
Результаты FISH |
N |
|
|
В-ОЛЛ |
Ж (n=9) |
M (n=6) |
5,55 |
Нет митозов |
t(12;21)/ETV/RUX1 |
15 |
|
В-ОЛЛ |
Ж (n=6) |
M (n=1) |
5,35 |
Нет митозов |
Трисомия 4, 10, 17 хромосом |
7 |
|
В-ОЛЛ |
Ж |
М |
2,45 |
Нет митозов |
t(1;19)/TCF3/PBX1 |
2 |
|
Т-ОЛЛ |
М |
3,6 |
Нет митозов |
SIL-TAL1 |
1 |
|
|
В-ОЛЛ |
М |
2 |
Нет митозов |
MLL |
1 |
|
|
Т-ОЛЛ |
М |
11 |
Нет митозов |
TLX3 |
1 |
|
|
В-ОЛЛ |
Ж (n=6) |
М (n=9) |
4,46 |
47-58XX/XY,+4,+10,+17 |
Аномалии не выявлены |
15 |
|
B-ОЛЛ |
Ж |
4 |
46XX,rob(14;21)(q10,q10),+21 [10] |
Аномалии не выявлены |
1 |
|
|
B-ОЛЛ |
М |
9 |
46XY,t(5;7)(q14;q11)[5] |
Аномалии не выявлены |
1 |
|
Среди них в 15 случаях (34%) флуоресцентной гибридизацией была обнаружена t(12;21)/ETV/RUNX1 при отсутствии митозов в стандартном цитогенетическом анализе. Подобные же наблюдения отмечались при детекции гипердиплоидного клона: в 7 случаях (16%) методом кариотипирования аномалия не была выявлена, а в 15 случаях (34%) обнаружена при стандартном кариотипировании и не подтверждена FISH-методом. Кроме того, у 3 детей методом FISH была обнаружена трисомия 4, 10, 17 хромосом при нормальном кариотипе, выявленном цитогенетическим методом. В 2 случаях в результате кариотипирования были обнаружены робертсоновская транслокация t(14;21), а также t(5;7), не подтвердившиеся при проведении FISH.
Подобное наблюдение соответствует данным, полученным Г.А. Цауром и соавт. [2011], исследовавшими особенности выявления различных генетических аномалий у детей с острыми лейкозами с помощью цитогенетического исследования, гибридизации in situ и ПЦР с обратной транскрипцией. По итогам изучения авторами также отмечается некоторое количество пациентов с перестройками MLL, обнаруженными методом ПЦР с обратной транскрипцией и не идентифицированными методом стандартного кариотипирования. Подобные расхождения в результатах исследований, по мнению авторов, наиболее часто ассоциированы с низкой чувствительностью цитогенетических методов к криптическим аберрациям [11]. Немаловажным критерием снижения чувствительности стандартного цитогенетического исследования может служить также сниженная митотическая активность гипердиплоидного клона лейкозных клеток [6]. Однако также отмечается возможность снижения чувствительности метода вследствие малого количества проанализированных метафазных пластинок, составляющих в среднем 8–12 метафаз.
Заключение. ОЛЛ у детей отличаются значительной гетерогенностью и сопровождаются большим количеством молекулярно-генетических аномалий. При этом распространенность перестроек различного типа значительно изменяется с увеличением возраста больных. В связи с этим особенно важной является диагностика генетических аномалий, которая может быть сопряжена с большой долей ошибочных результатов, а также со снижением эффективности проводимой терапии. Поэтому наиболее целесообразным представляется комплексное использование молекулярно-генетических и цитогенетических методов для детекции хромосомных аберраций у больных детей.