Хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) продолжает оставаться исключительно острой проблемой современной медицины, несмотря на большие достижения в последние десятилетия в расшифровке ее патогенеза, разработке методов диагностики и лечения [1]. До сих пор нет окончательной ясности в патогенетических механизмах, поддерживающих воспалительный процесс при ХОБЛ. В последние годы получены доказательства важной роли в патогенезе развития данного заболевания иммунологических триггеров как в слизистой бронхов, так и в целом в организме [2]. Целью нашего исследования явилось изучение взаимоотношений между иммунологическими процессами, реализующимися на местном и системном уровнях при ХОБЛ.
Материал и методы исследования. В исследование включали больных ХОБЛ, поступающих на стационарное лечение в пульмонологическое отделение Республиканской клинической больницы Минздрава Чувашии. Критериями включения служили: 1) первый эпизод обострения ХОБЛ с момента диагностики заболевания; 2) ХОБЛ легкого (GOLD I) и среднетяжелого течения (GOLD II); 3) возраст от 40 до 80 лет; 4) лица обоего пола. В качестве критериев исключения рассматривали: 1) ХОБЛ тяжелого (GOLD III) и крайне тяжелого (GOLD IV) течения; 2) сопутствующие заболевания: туберкулез легких, интерстициальные заболевания, бронхиальную астму, гипертоническую болезнь, ишемическую болезнь сердца, цереброваскулярные заболевания; 3) когнитивные нарушения; 4) беременность; 5) дисфункции печени и почек; 6) отказ от участия в исследовании.
ХОБЛ диагностировали в соответствии с рекомендациями международного документа по ХОБЛ ‑ GOLD (от англ. «Global Initiative for Chronic Obstructive Lung disease»), 2006 (исследование начали с 2005 г.) [3]. При этом основным критерием являлось снижение значения спирометрического показателя ‑ отношения объема форсированного выдоха за первую секунду (ОФВ1) к форсированной жизненной емкости легких (ФЖЕЛ) ‑ ОФВ1 / ФЖЕЛ менее 70%. Обострение заболевания устанавливали, руководствуясь критериями Anthonisen [4]. Больным проводили стандартные общеклинические лабораторные тесты крови, мокроты, мочи и инструментальные исследования (спирометрию, бронхоскопию, рентгенологическое обследование органов грудной клетки, при необходимости бронхографию). Кроме того, осуществляли цитологическое исследование бронхоальвеолярной жидкости (БАЖ), иммунологические исследования крови и БАЖ. Протокол иммунологического исследования включал: оценку фагоцитарной активности лейкоцитов в периферической крови и БАЖ (латекс-тест, тест восстановления нитросинего тетразолия ‑ НСТ-тест), идентификацию лимфоцитов Т- и В-популяций, субпопуляций Т-клеток периферической крови методом прямой иммунофлюоресценции с использованием моноклональных антител (МКАТ) ‑ CD3, CD20, CD4, CD8 (Beckman Coulter) на проточном цитометре Fc500, определение уровней циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) путем осаждения полиэтиленгликолем в сыворотке крови, а также иммуноглобулинов (IgA, IgG, IgM) в сыворотке крови и БАЖ, оценку показателей цитокинового профиля: определение концентрации интерлейкинов (IL) ‑ IL-1β, IL-2, IL-4, IL-8, интерферона-γ (IFN-γ) в сыворотке крови и БАЖ с использованием иммуноферментных тест-систем ООО «Цитокин» (Санкт-Петербург). Кроме того, оценивали способность лимфоцитов вырабатывать основные цитокины адаптивного иммунитета (IFN-γ и IL-4) при культивировании лимфоцитов в течение 24 ч in vitro. Названные исследования выполняли по стандартным общепринятым методикам, описанным ранее [5]. Статистическую обработку данных проводили, используя программу «Statistica ‑ 10». Cтепень различий количественных показателей в группах оценивали по t-критерию Стьюдента (р), качественных показателей ‑ по критерию χ2 (кси-квадрат). Корреляционный анализ проводили с использованием метода Спирмена, достоверными считали корреляционные связи при p<0,05. При анализе лабораторных показателей крови и параметров функции внешнего дыхания больных ориентировались на референсные показатели, полученные при обследовании контрольной группы, состоящей из 40 практически здоровых лиц, возраст и гендерный состав которых были сопоставимы с таковыми когорты больных ХОБЛ (табл. 1), в то время как цитологические и иммунологические показатели БАЖ у больных были сравнены с референсными значениями, известными из литературных источников [6, 7, 8]. Исследование было одобрено Этическим комитетом медицинского факультета Чувашского государственного университета имени И.Н. Ульянова. Все обследованные были ознакомлены с протоколом исследования, ими было подписано добровольное информированное согласие на участие в исследовании.
Результаты исследования и их обсуждение. В группу исследования были отобраны 116 больных ХОБЛ, поступивших на стационарное лечение в период обострения заболевания.
Таблица 1
Клинико-демографическая характеристика группы больных ХОБЛ
|
Показатель |
Контрольная группа |
Больные ХОБЛ |
|
|
Количество |
40 |
116 |
|
|
Пол (мужчина/женщина) |
31/9 |
92/24 |
NS |
|
Курящие/прекратившие табакокурение/некурящие |
5/13/22 |
49/57/10 |
χ2<0,001 |
|
Возраст (года) |
53,6 ± 2,7 |
56,9±8,28 |
NS |
|
Индекс курения (пачка/год) |
12,2±4,2 |
21,8 ± 6,7 |
p<0,001 |
|
ОФВ1 постбронходилатационный* |
99,6±10,5 |
52,4±16,9 |
p<0,001 |
|
ОФВ1/ФЖЕЛ* |
97,5±10,8 |
66,2±12,34 |
p<0,001 |
|
CAT, баллы |
0 |
9,2±1,2 |
p<0,001 |
Примечания: * ‑ значения показателей представлены в процентах от должных величин; p ‑ степень достоверности различий количественных показателей в обследованных группах; χ2 ‑ степень достоверности различий качественных (категориальных) показателей в обследованных группах; NS ‑ различие не достоверно (p>0,05, χ2>0,05).
Анализ результатов исследования выявил ряд существенных отклонений в показателях общего анализа крови в группе больных ХОБЛ относительно значений контрольной группы. В частности, у больных были повышены показатели скорости оседания эритроцитов (СОЭ) до 19,1±14,3 (p<0,001) и содержания лейкоцитов до (7234±247)х106/л (p<0,001) за счет увеличенного количества нейтрофилов (4033±760)х106/л (p<0,001), эозинофилов (244±179) х106/л (p<0,001) и моноцитов (594±224) х106/л (p<0,001). При этом у больных было уменьшено относительное значение содержания в крови лимфоцитов (33,0±11,2%, p<0,05). Приведенные данные позволяют думать, что обострение ХОБЛ ассоциировано с активацией воспалительного процесса, обусловленного инфекцией, в котором нельзя исключить и роль аллергического компонента, связанного с пролиферативной активностью эозинофилов.
Обнаруживались значительные изменения в иммунологических показателях крови (табл. 2): уменьшение содержания CD3+- и CD3+CD4+- клеток на фоне повышения в сыворотке крови уровней IgM, IgА, IgЕ и ЦИК. Полученные данные свидетельствуют об активации гуморального звена адаптивного иммунитета, что может быть связано с аутоиммунными процессами, происходящими в легких при ХОБЛ. Согласно литературным данным, при ХОБЛ наблюдается продукция аутоантител к эластину, к антигенам эпителия дыхательных путей, что может быть инициировано длительным табакокурением [9, 10]. Повышенный уровень ЦИК может свидетельствовать об иммунокомплексном повреждении тканей органов дыхания при ХОБЛ. Кроме того, нельзя исключать вклад в иммунопатологический воспалительный процесс при ХОБЛ и реагинового, IgЕ-опосредованного механизма повреждения тканей, что подтверждается увеличением числа эозинофилов и уровня IgE в крови. Другие авторы описали эозинофильный фенотип ХОБЛ, отличающийся тяжелым течением [11, 12]. Повышение содержания в крови абсолютного числа моноцитов, нейтрофилов, в том числе фагоцитирующих нейтрофилов, связано со стимуляцией врожденного иммунитета. Активация воспалительного процесса при обострении ХОБЛ ассоциирована со стимуляцией клеток врожденного иммунитета, продуцирующих провоспалительные цитокины. Действительно, в группе больных ХОБЛ оказались повышенными уровни циркулирующих в крови раннего провоспалительного цитокина ‑ IL-1β и хемоаттрактанта с провоспалительным эффектом ‑ IL-8. Были повышены относительно группы здоровых лиц уровни IL-4 (цитокин, продуцируемый Т-хелперными клетками 2-го типа ‑ Th2) и IFN-γ (основной цитокин Т-хелперных клеток 1-го типа ‑ Th1-клеток), что наводит на мысль об активации при ХОБЛ как Th2/гуморального, так и Th1/клеточного звеньев адаптивного иммунитета. Однако обнаруженное в результате исследования увеличение соотношения IFN-γ/IL-4 позволяет думать о преобладании активности клеточного компонента адаптивного иммунитета. С целью определения преобладающего типа продукции цитокинов было проведено определение содержания IFN-γ и IL-4 в супернатанте 24-часовых культур лимфоцитов. Результаты этого исследования демонстрировали повышенные уровни IFN-γ и IL-4 при ХОБЛ. При этом значения соотношения IFN-γ/IL-4 также оказались выше, чем у здоровых, что подтвердило предположение о преобладании в адаптивном иммунном ответе больных активности Th1-клеточного звена. Уменьшенное содержание в периферической крови общего числа Т-лимфоцитов (CD3+) и Т-хелперных клеток (CD3+CD4+) можно объяснить тем, что данные клетки покидают кровяное русло и оказываются в очаге воспалительного процесса ‑ в дистальных бронхах и легких. Это подтверждено и данными других авторов, обнаруживших скопления лимфоидных клеток в дыхательных путях и ткани легких у больных ХОБЛ, сопутствующие аутоиммунным процессам клеточного типа [13, 14].
Таблица 2
Показатели иммунного статуса и цитокинового профиля у больных ХОБЛ и здоровых лиц
|
Показатель |
Контрольная группа (здоровые) n=40 |
Больные ХОБЛ n=116 |
р |
|
M±SD |
M±SD |
||
|
Кровь |
|||
|
CD3+-клетки, % |
62,5±6,4 |
57,23±10,23 |
0,001 |
|
CD20+-клетки, % |
14,1±4,1 |
16,33±8,31 |
NS |
|
CD3+CD4+-клетки, % |
37,0±6,33 |
33,17±9,27 |
0,01 |
|
CD3+CD8+-клетки, % |
24,3±3,2 |
23,28±5,75 |
NS |
|
CD3+CD4+/ CD3+CD8+ |
1,50±0,32 |
1,43±0,57 |
NS |
|
IgM, г/л |
1,14±0,21 |
1,63±0,84 |
0,001 |
|
IgG, г/л |
11,6±1,4 |
12,33±4,96 |
NS |
|
IgA, г/л |
1,76±0,47 |
3,12±2,03 |
0,001 |
|
IgE общий, МЕ/л |
36,2±9,2 |
70,8±17,8 |
0,001 |
|
ЦИК, усл. ед. |
8,6±4,1 |
13,29±8,41 |
0,001 |
|
Фагоцитарный индекс, % |
64,2±14,2 |
52,0±18,6 |
0,001 |
|
Абсолютное число фагоцитирующих нейтрофилов, ×106/л |
1930±320 |
2097±410 |
0,010 |
|
IL-1β, пг/мл |
0,4±0,1 |
202,7±270,3 |
0,001 |
|
IL-8, пг/мл |
2,6±0,7 |
26,87±39,44 |
0,001 |
|
IL-4, пг/мл |
1,75±0,5 |
9,83±4,11 |
0,001 |
|
IFN-γ, пг/мл |
6,2±2,1 |
112,14±53,04 |
0,001 |
|
IFN-γ/ IL-4 |
3,5±0,8 |
11,3±4,8 |
0,001 |
|
Супернатанты культуральных МНК |
|||
|
IL-4, пг/мл |
14,6±3,12 |
24,7±4,9 |
0,001 |
|
IFN-γ, пг/мл |
17,95±5,24 |
41,5±8,49 |
0,001 |
|
IFN-γ/ IL-4 |
1,2±0,3 |
1,7±0,49 |
0,001 |
Примечания: p ‑ степень достоверности различий между показателями больных и здоровых по t-критерию Стьюдента; NS ‑ различие не достоверно (p>0,05).
Таким образом, характер изменений иммунологических показателей на системном уровне у больных ХОБЛ укладывается в картину активации врожденного иммунитета (с участием моноцитов и нейтрофилов) в сочетании с индукцией активности адаптивного иммунитета с преобладанием функции его клеточной составляющей, а также участие в воспалительном процессе IgE-опосредованного аллергического компонента. В целом такой же характер иммунного реагирования на обострение ХОБЛ нами был установлен на местном уровне: результаты цитологического и иммунологического исследования демонстрировали преобладание в БАЖ больных нейтрофильных клеток, повышение уровней иммуноглобулинов и цитокинов, увеличение значения IFN-γ/IL-4 (табл. 4). Исключением являлся характер изменения числа клеток моноцитарно-макрофагального ряда, которое было уменьшено в БАЖ по сравнению с показателем здоровых лиц, в то время как в крови оно было увеличено. Подробное описание особенностей фагоцитарного звена защиты на местном уровне при ХОБЛ мы представляли ранее [15].
Таблица 3
Показатели цитологического и иммунологического исследования БАЖ у больных ХОБЛ
|
Показатель |
Референсные значения |
Больные ХОБЛ n=116 |
р |
|
M±SD |
M±SD |
||
|
Нейтрофилы, % |
4,1±0,49 [6] |
60,35±21,31 |
<0,001 |
|
ФИН, % |
34,05±3,1[6] |
21,61±12,6 |
<0,001 |
|
НСТН, % |
‑ |
6,21±3,62 |
|
|
Альвеолярные макрофаги, % |
64,60±2,04[6] |
12,95±9,36 |
<0,001 |
|
ФИМ, % |
55,5±3,3[6] |
31,23±17,54 |
>0,001 |
|
НСТМ, % |
50,6±16,2[6] |
19,12±10,20 |
<0,001 |
|
Лимфоциты,% |
27,6±1,8[6] |
3,1±0,8 |
<0,001 |
|
IgG, г/л |
0,45±0,04[6] |
6,47±1,38 |
<0,001 |
|
IgA, г/л |
0,2±0,02[6] |
2,24±0,73 |
<0,001 |
|
IgM, г/л |
0 [6] |
15,16±4,01 |
<0,001 |
|
IgЕ, МЕ/мл |
‑ |
15,5±12,3 |
‑ |
|
IL-1β, г/л |
28,31±7,99 [7] |
570,3±254,3 |
<0,001 |
|
IL-4, пг/мл |
5,81+1,33 [7] |
48,7±14,4 |
<0,001 |
|
IL-8, пг/мл |
132,0+17,76[7] |
3806±2002 |
<0,001 |
|
IFN-γ, г/л |
2,30±0,10 [8] |
501±172 |
<0,001 |
|
IFN-γ/IL-4 |
‑ |
47,62±17,62 |
‑ |
Примечания: ФИН - фагоцитарный индекс нейтрофилов; НСТН ‑ показатель НСТ-теста нейтрофилов; ФИМ ‑ фагоцитарный индекс макрофагов; НСТМ ‑ показатель НСТ-теста макрофагов; p ‑ степень достоверности различий между показателями больных и здоровых по t-критерию Стьюдента.
По всей видимости, иммунные реакции, характерные для обострения ХОБЛ, инициируются на бронхоальвеолярном уровне. Это касается продукции раннего провоспалительного цитокина IL-1β, хемоаттрактанта IL-8, патогенетически значимого IFN-γ, уровни которых в БАЖ превышают их сывороточные уровни в 2,82 раза, в 136 раз и в 4,5 раза соответственно. Значительное повышение уровня IgМ в БАЖ обусловлено, скорее всего, местным усилением продукции данного класса иммуноглобулинов на бронхоальвеолярном уровне, среднее значение содержания IgМ в БАЖ превышало в 9,3 раза аналогичный показатель в сыворотке крови. Обращает внимание наличие достаточно большого количества корреляционных связей между показателями БАЖ, в том числе прямые связи между уровнями цитокинов, между уровнями иммуноглобулинов (табл. 4). Меньшее число связей обнаружено между показателями БАЖ и сыворотки крови, и всего лишь четыре корреляции ‑ между сывороточными показателями. Приведенные данные свидетельствуют о тесной взаимосвязи большинства показателей БАЖ между собой, в отличие от сывороточных показателей.
Таблица 4
Статистически значимые корреляционные связи уровней цитокинов и иммуноглобулинов
|
|
IgG |
IgM |
IgA |
IgE |
IL-1β |
IL-4 |
IL-8 |
IFN-γ |
|
IgG |
|
|
|
‑0,63 б-б |
|
|
|
|
|
IgM |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
IgA |
|
0,64 б-б |
|
|
|
|
|
|
|
IgE |
|
|
‑0,59 б-б |
0,60 б-с |
0,57 б-б 0,60 б-с |
0,79 б-б |
0,53б-с
|
0,90 б-б |
|
IL-1β |
|
|
|
0,68с-с |
|
|
|
|
|
IL-4 |
|
|
|
0,61 с-с |
0,52 б-б |
|
0,59 б-б |
0,63 б-б |
|
IL-8 |
|
|
|
0,87 б-б 0,82 с-с |
|
0,63 б-с |
|
0,69 б-б |
|
IFN-γ |
-0,62 б-б |
|
‑0,53 б-б |
‑0,57 с-с 0,61 б-с |
|
0,85 б-с |
|
|
Примечания: в ячейках таблицы числовые значения обозначают коэффициент корреляции по Спирмену (rs); верхние индексы обозначают: б-б ‑ корреляционную связь между показателями БАЖ, с-с ‑ связь между показателями сыворотки крови, б-с ‑ связь между показателем БАЖ и показателем сыворотки крови.
Заключение. Иммунные реакции, характерные для ХОБЛ, инициируются на бронхоальвеолярном уровне и впоследствии приобретают системный характер. Наиболее важным звеном иммунопатогенеза заболевания является активация Th1-опосредованного хронического воспаления, маркеры которого прослеживаются на местном и системном уровнях.