Рак легких остается наиболее часто диагностируемым видом злокачественного новообразования человека, в том числе и в РФ [1]. Мутации, активирующие рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), характеризуют подгруппу немелкоклеточного рака легкого, для которого эффективны ингибиторы тирозинкиназы EGFR (EGFR-TKI), что значительно улучшило клинические исходы при НМРЛ с мутантным EGFR [2]. EGFR-TKI «первого поколения», включая гефитиниб и эрлотиниб, теперь являются стандартным лечением НМРЛ [3].
Несмотря на высокую частоту ответа на TKI (до 70% при использовании гефитиниба в качестве первой линии), период ответа обычно длится менее 12 месяцев [4]. Резистентность к таргетной терапии, развивающаяся часто вследствие появления вторичных мутаций как в гене EGFR (T790M), так и в других онкогенах (MET), дала толчок к развитию ингибиторов «следующего поколения» (например, осимертиниб) и иммунотерапии, которые расширили терапевтический арсенал онкологов. Однако, до того как доступность новых ингибиторов тирозин-киназ для пациентов улучшится, ингибиторы первого поколения все еще играют неоценимую роль в лечении мутантного по EGFR НМРЛ.
Сведения о частоте мутаций в гене EGFR значительно разнятся в зависимости от популяционной принадлежности пациентов. Например, исследования европейских когорт фиксировали данный показатель в диапазоне 10-20% [5; 6], тогда как для материкового Китая частота мутаций составила половину случаев аденокарциномы лёгкого, из которых в 48,0% фиксировали активирующие мутации [7]. Крым является особым этногеографическим регионом, в котором в силу исторических и сопутствующих этому миграционных процессов сложилась смешанная этническая структура населения с превалированием славянской и крымско-татарской этнической группы. Исследования распределения частоты клинически значимых альтераций генов EGFR, ALK, ROSI у больных с НМРЛ в указанных группах до настоящего времени не проводились.
Цель нашей работы состояла в анализе ретроспективной когорты крымских пациентов с распространенным НМРЛ, получавших хирургическое и химиотерапевтическое лечение, на наличие аберраций гена EGFR и возможной ассоциации с клиническим исходом.
Материалы и методы исследования
Исследование включало 100 больных европеоидного типа, проживающих на территории Республики Крым, в возрасте 46-78 лет (медиана 64 года), 82% - мужчин, 18% - женщин, с диагнозом «рак легкого T1а-4N0-2M0-1» (стадия I-IV), проходивших плановое лечение в «Медицинской академии имени С.И. Георгиевского» Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего образования «Крымский федеральный университет имени В.И. Вернадского» (ФГАОУ ВО «КФУ им. В.И. Вернадского») в 2015-2017 гг. Все пациенты подписали добровольное информированное согласие на обработку персональных данных и передачу сведений, составляющих врачебную тайну, а также на передачу биологического материала.
В ретроспективной выборке пациентов с диагнозом «рак легкого» (N=100) после пересмотра препаратов злокачественных опухолей двумя опытными морфологами был подтвержден диагноз «аденокарцинома» у 41 пациента и плоскоклеточный рак у 57 пациентов. В двух случаях морфологический подтип соответствовал крупноклеточной опухоли.
Для генетических исследований тотальную ДНК экстрагировали из парафиновых блоков опухолевой и условно здоровой ткани, как описано ранее [8]. Оценку относительной копийности EGFR проводили методом ПЦР в реальном времени согласно [9] с использованием в качестве референсных генетических локусов GAPDH, B2M. Последовательности праймеров для EGFR были разработаны на базе данных NCBI GenBank в программе Primer-BLAST (F: 5’-GCCAAGTAAGGGCGTGTCT-3’; R: 5’- GGCCGAAGAACGAAACGTC-3’).
С помощью набора «therascreen EGFR RGQ PCR Kit» (Qiagen, Германия) определяли наличие мутаций в гене EGFR методом аллель-специфичной ПЦР в реальном времени согласно инструкции производителя. Таким образом, идентифицировали девять делеций в экзоне 19, L858R, T790M, L861Q, G719S/A/C, 3 инсерции в экзоне 20, S768I.
Статистический анализ и оценку достоверности различий проводили в программе Statistica v.10. Результаты анализа считали значимыми при значении р<0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
По итогам предварительных ПЦР-постановок референсных локусов GAPDH, B2M амплификабельностью обладали только 72 препарата ДНК, выделенные из тканей злокачественных опухолей.
Оценка копийности EGFR продемонстрировала случаи амплификации локуса в 9 (30%) образцах аденокарцином, значимой потери относительной копийности при этом морфологическом подтипе зафиксировано не было. В группе плоскоклеточного рака преобладала амплификация локуса в 25 из 42 (59,6%) образцов, в 4 (9,5%) образцах было отмечено снижение копийности. В итоге различия по частоте аберрантного изменения относительной копийности EGFR в группах аденокарциномы и плоскоклеточного рака легкого были достоверными (χ2 = 11,04 при р=0,003).
Генотипирование не выявило идентифицируемых мутаций EGFR в выборке плоскоклеточного рака легкого.
Общая частота мутаций EGFR в крымской выборке с подтвержденным морфологически диагнозом «аденокарцинома легкого» составила 9,7%. При этом были обнаружены исключительно делеции в 19 экзоне (ex19del) у некурящих женщин старше 55 лет. Согласно данным My Cancer Genome, ex19del EGFR - одно из наиболее часто встречающихся генетических изменений при НМРЛ. Ожидаемая общая частота соматических мутаций в гене EGFR при этой патологии колеблется от 10 до 50% [5-7].
На рисунке ниже проиллюстрирован анализ частоты мутаций EGFR в крымской выборке пациентов по сравнению с опубликованными ранее данными для пациентов с аденокарциномой легкого, проживающих в Южном федеральном округе (ЮФО) РФ [5].
Распределение частот соматических мутаций EGFR в выборке РК (Республика Крым) и ЮФО
Частота мутаций, сенсибилизирующих к таргетной анти-TKI терапии, в крымской популяции (9,7%) оказалась меньше обычно регистрируемой в европейских популяциях пациентов с аденокарциномой (14,4%, 16,6%) [5; 6]. Кроме того, отмеченные различия частот мутаций были значимы при сравнении популяций Южного федерального округа и Республики Крым (χ2 = 4,40 при р=0,036).
Особенностью крымской группы также являлось отсутствие одной из наиболее часто идентифицируемых при НМЛР мутации L858R. Кроме того, не было идентифицировано опухолей с мутацией T790M, обуславливающей первичную резистентность к EGFR-TKI первого поколения.
За четырёхлетний период наблюдения была собрана информация об общей выживаемости для 78 пациентов (таблица). После корректировки учёта летальных исходов, не связанных с основным заболеванием, выявленная смертность составила 68,7% в группе с аденокарциномой и 52,2% в группе с плоскоклеточным раком.
Показатель смертности (на декабрь 2020 г.) в исследованных группах больных раком легкого
|
Смертность |
Аденокарцинома |
Плоскоклеточный рак |
||
|
Абс. число |
% |
Абс. число |
% |
|
|
общая |
26 |
81,3 |
29 |
63,0 |
|
связанная с основным заболеванием |
22 |
68,7 |
24 |
52,2 |
|
Количество пациентов |
32 |
100 |
46 |
100 |
Выявленный высокий показатель смертности связан, по-видимому, с доступной в 2014-2017 годах схемой лечения, включавшей только хирургическое лечение и химиотерапию.
В настоящем исследовании не была выявлена ассоциация мутации EGFR со стадией заболевания и общей выживаемостью пациентов с НМРЛ. Однако низкая частота мутаций, которая была зафиксирована в крымской выборке, может привести к недостаточной мощности для обнаружения статистически значимых связей. Поэтому для оценки влияния аберрации на выживаемость мы объединили все обнаруженные изменения в гене EGFR – мутации и изменение копийности. По результатам регрессионного анализа было выявлено, что пациенты с любым изменением EGFR имели более короткие значения общей выживаемости, чем пациенты без изменений (р = 0,034).
Проведение таргетной терапии в рассматриваемой ретроспективно группе пациентов РК не представлялось возможным, в том числе по причине отсутствия генетического тестирования в широкой клинической практике в Республике Крым в 2014-2017 гг. В связи с этим ассоциация между мутационным статусом EGFR и выживаемостью пациентов была оценена аналогично представленной в литературе тенденции и в целом снижала этот показатель.
Проведенное исследование в выборке пациентов с НМРЛ, проживающих на территории Республики Крым, продемонстрировало некоторые гистологические и генетические особенности. Согласно мировой статистике, наиболее распространенными подтипами немелкоклеточного рака легкого являются аденокарцинома (40-50%) и плоскоклеточный рак (25-40%) [10]. Напротив, в когорте крымских пациентов преобладали пациенты с диагнозом «плоскоклеточный рак» (57%).
Лечение ингибиторами тирозинкиназы EGFR (TKI, например, эрлотиниб, гефитиниб и афатиниб) у пациентов с аденокарциномой, положительной по мутации EGFR, значительно улучшило выживаемость без прогрессирования (ВБП). Мутации с делециями в экзоне 19 и мутации с однонуклеотидной заменой L858R в экзоне 21 являются наиболее частыми при НМРЛ и называются «классическими» сенсибилизирующими мутациями [11]. Известно, что активирующие мутации рецептора эпидермального фактора роста имеют место приблизительно у 40-50% пациентов с аденокарциномой легкого азиатской расы и у 10–20% таких пациентов европейской расы [5-7; 11]. В целом выявленная у крымских пациентов частота мутаций EGFR соответствовала таковой в европейских популяциях, но была ниже по сравнению с пациентами ЮФО [5] и включала исключительно делеции в экзоне 19.
Предыдущие отчеты продемонстрировали убедительные доказательства связи между клинико-патологическими особенностями (например, статусом курения, полом, возрастом) и частотой мутаций EGFR при немелкоклеточном раке легкого [5; 12]. В частности, отмечено постепенное возрастное увеличение частоты мутаций EGFR у пациентов с раком легких. Например, у пациентов ЮФО частота сенсибилизирующих мутаций была увеличена в возрастной группе ≥ 61 года (p = 0,048) по сравнению с возрастной группой ≤ 61 года, в то же время продемонстрировано значительное снижение частоты как сенсибилизирующих, так и резистентных мутаций у бывших курильщиков (p = 0,001 и p = 0,04 соответственно) по сравнению с группой никогда не куривших. Наличие мутаций EGFR также было достоверно связано с женским полом и отказом от курения [5]. В крымской выборке отмечено наличие мутации EGFR только у женщин, что подтверждает тенденцию меньшей частоты обнаружения мутаций у мужчин, даже после поправки на курение.
Исследованная выборка характеризовалась наличием отдаленных метастазов у 5% пациентов уже на стадии первичной постановки диагноза. В литературе описаны прямо противоположные тенденции, связывающие наличие в опухоли активирующих мутаций в гене EGFR и метастазирование в мозг [5]. На фоне противоречивых оценок у ряда авторов мы не смогли связать наличие аберраций EGFR с риском метастазов в региональные лимфоузлы или различные участки тела (p> 0,05).
Предыдущие исследования, посвященные изучению клинического прогноза, демонстрировали либо отсутствие [13], либо, наоборот, значительную разницу [2] в клинических характеристиках между пациентами с немелкоклеточным раком легкого, несущими делецию экзона 19 (ex19del) и точечную мутацию в 21 экзоне (L858R) гена EGFR. Несущественные различия в выживаемости между пациентами с разными генотипами опухолей были приписаны влиянию значительно более молодого возраста группы с ex19del по сравнению с группой носителей мутации L858R [13]. Тем не менее предшествующие исследования показали, что пациенты с ex19del характеризуются более продолжительной общей выживаемостью после лечения TKI первой линии по сравнению с пациентами с мутацией L858R [14].
Механизмы различной чувствительности к EGFR-TKI опухолей, несущих ex19del или L858R, не ясны. Они могут быть связаны как с интенсивностью активации EGFR-сигнального пути, так и со схемой реализации онкогенеза при наличии ex19del или L858R. Например, известно, что мутация L858R чаще встречается в сочетании с другими более редкими мутациями, такими как L861Q, G719X, G719X и ex20Ins [5], что, очевидно, также влияет на чувствительность к лечению EGFR-TKI.
В работе Hong W. и соавторов [2] была проанализирована выживаемость без прогрессирования 137 пациентов с распространенным НМРЛ и мутациями EGFR, которые были разделены на группы по типу лечения (химиотерапия, терапия ингибиторами TKI в первой линии и во второй линии). Авторы продемонстрировали значимое увеличение у носителей мутации ex19del после терапии TKI в первой линии, тогда как не было отмечено различий между группами ex19del и L858R после химиотерапии и терапии TKI во второй линии. Одновременно у носителей L858R большую выгоду получали пациенты, перенесшие химиотерапию с последующей терапией TKI, чем пациенты, лечившиеся TKI в первой линии. Результаты исследования предполагают персонификацию лечения пациентов с распространенным НМРЛ не только по наличию мутаций в EGFR, но и по типу активирующей мутации.
Анализ логистической регрессии наших данных показал, что женский пол, возраст, морфологический подтип, отдаленные метастазы и химиотерапия не связаны с мутацией гена EGFR у пациентов с НМРЛ, однако это может быть связано с низкой частотой аберрации и недостаточностью объёма выборки.
Настоящее пилотное исследование выявило особенности опухолей НМРЛ крымских пациентов, что диктует необходимость дальнейших исследований для оценки представленности в популяции более редких клинически значимых биомаркеров, а также для планирования медицинской помощи этой категории больных.
Выводы
Пациенты с немелкоклеточным раком легкого крымской популяции чаще демонстрируют плоскоклеточный подтип заболевания (57%). При отсутствии L858R частота активирующей мутации ex19del гена EGFR в случаях аденокарциномы составляет 9,7%. Более частая альтерация EGFR была выявлена при оценке копийности локуса в опухоли относительно условно нормальной ткани: изменения зафиксированы для 30% случаев аденокарциномы легкого и 69,1% плоскоклеточного рака. Наличие мутаций и/или изменение копийности EGFR связаны с более коротким периодом общей выживаемости пациентов, не получавших таргетной или иммунной терапии.