Индивидуализация лечебно-восстановительных мероприятий при нейродегенеративных и ишемических повреждениях центральной нервной системы в последние годы приобретает особое значение. Такие индивидуальные особенности, как стрессоустойчивость и уровень когнитивных способностей, перекочевали из разряда диагностируемых величин в область факторов риска. Современные исследования демонстрируют тесную взаимосвязь состояния когнитивной функции с выраженностью оксидантного стресса [1]. Физическая нагрузка является неотъемлемым компонентом реабилитационных мероприятий при церебральной гипоперфузии, характерной для подавляющего числа цереброваскулярных заболеваний. Предполагается, что улучшение когнитивных функций под ее воздействием связано с высвобождением нейротрофического фактора мозга (BDNF) из церебральных эндотелиальных клеток под воздействием окислительного стресса [2]. Следует отметить, что высвобождение BDNF под влиянием физических нагрузок имеет ряд индивидуальных особенностей: величина этих эффектов у женщин ниже по сравнению с мужчинами [3].
Цель нашего исследования – выявить особенности протекания оксидантного стресса при экспериментальной церебральной гипоперфузии и моделировании реабилитационных мероприятий в зависимости от способности животных к обучению.
Материал и методы исследования
Эксперимент проводился на 240 крысах Wistar (120 самцов и 120 самок). Исследование одобрено Этическим комитетом ФБОУ ВО «ЯГМУ» Минздрава России (протокол № 8 от 24.03.2016 г.) и выполнен в соответствии с Хельсинкской декларацией 1975 г., а также ее пересмотренным вариантом 2000 г. и Приказом Минздрава России от 01.04.2016 г. № 199н «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики». Билатеральная окклюзия обеих общих сонных артерий под внутрибрюшинным наркозом золетилом была использована в качестве модели хронической церебральной гипоперфузии. Накануне оперативного вмешательства животных тестировали в водном лабиринте Морриса для оценки уровня когнитивных способностей[4]. По результатам тестирования крысы обоего пола были разделены на две подгруппы: с высоким уровнем когнитивных способностей (ВУК) и низким уровнем развития когнитивных способностей (НУК). Впоследствии прооперированные крысы сформировали группу сравнения (128 животных, из которых 64 – животные с ВУК, и 64 – животные с НУК) и экспериментальную группу (112 животных), также включающую в себя одинаковое количество животных с ВУК и с НУК. Животные экспериментальной группы, начиная с 7-х суток после операции, ежедневно подвергались плаванию в бассейне в течение 15 минут на протяжении 4 недель, то есть спустя 35 дней после операции физические нагрузки прекращались.
Концентрацию ТБК активных продуктов (малонового диальдегида – МДА) в плазме крови определяли спектрофотометрически. Концентрацию L-цитруллина (LC) и суммарную концентрацию нитрит- и нитрат-ионов (NО)-Х плазмы крови использовали для оценки эндогенной продукции оксида азота. Определение концентрации (LC) в плазме крови проводили по методике, основанной на реакции остатков LC с диацетилмоноксимом и оксидом железа (III) в кислой среде. Интенсивность окислительного стресса оценивали по антиоксидантной активности плазмы крови путем индуцирования в ней хемилюминесценции пероксидом водорода с сульфатом железа по стандартной методике на приборе БХЛ 07. Определяли: I max (мВ) – максимальную интенсивность свободнорадикальных процессов, за все время измерения; S (мВ×с) – светосумму; tgα (мВ/с). Все вышеперечисленные исследования выполняли у интактных животных, а также через 1, 6, 8, 14, 28, 35, 60 и 90 суток после операции в экспериментальной группе и группе сравнения. Статистический анализ первичных данных был проведен с использованием программного пакета StatSoft Statistica v 10.0. Значимость различий измеряемых параметров оценивали с помощью непараметрического критерия Манна–Уитни для двух независимых выборок. Между средними значениями исследуемых групп и подгрупп рассчитывался коэффициент корреляции Пирсона.
Результаты исследования и их обсуждение
Полученные данные в группе сравнения характеризуются стадийностью. В первые сутки исследования, спустя 24 часа после моделирования церебральной гипоксии, достоверная динамика большинства показателей отмечена только в подгруппе животных с низким уровнем когнитивных способностей: МДА, LC – достоверно возрастают; (NO)-X, Imax, tgα, S – достоверно снижаются (табл. 1).
Таблица 1
Динамика LC и NO-X в эксперименте
Сутки |
Группа сравнения |
Экспериментальная группа |
||||||
LC |
NO-X |
LC |
NO-X |
|||||
ВУК |
НУК |
ВУК |
НУК |
ВУК |
НУК |
ВУК |
НУК |
|
0 |
6,27±0,59 |
5,92±0,48 |
20,9±1,9 |
37,6±3,4 |
- |
- |
- |
- |
1 |
5,67±0,55 |
7,46±0,69* |
42±3,8* |
14,6±1,3* |
- |
- |
- |
- |
6 |
5,47±0,54 |
9,26±0,81* |
41,3±3,8* |
30,9±2,8* |
- |
- |
- |
- |
8 |
5,83±0,55 |
5,25±0,43 |
36±3,3* |
9,8±0,9* |
5,47±0,54 |
9,26±0,86# |
44,5±4,0# |
9,9±0,9 |
14 |
6,84±0,68 |
6,58±0,54 |
25±2,1* |
20,6±1,9* |
5,79±0,55 |
3,55±0,34# |
22,0±2,0 |
4,3±0,4# |
21 |
5,61±0,55 |
3,67±0,36 |
22,6±2,1 |
5,8±0,5* |
6,87±0,61# |
6,48±0,57# |
10,5±1# |
8,8±0,8# |
28 |
5,38±0,44 |
6,78±0,53 |
30,7±2,8 |
31,9±2,9* |
6,26±0,58 |
5,7±0,45 |
33,6±3,1 |
31,9±2,9 |
35 |
6,93±0,65 |
4,86±0,44* |
82,8±7,5* |
135,8±12,3* |
5,96±0,55 |
6,84±0,6# |
52,4±4,8# |
26±2,4# |
60 |
8,88±0,72* |
9,8±0,82* |
13,5±1,2* |
34,5±3,1 |
5,1±0,43# |
7,79±0,69# |
30,4±2,8# |
27,5±2,5# |
90 |
6,35±0,49 |
8,09±0,65* |
6,2±0,6* |
18,2±1,7* |
6,93±0,64 |
9,11±0,77 |
2,3±0,2# |
1,2±0,1# |
Примечание. * - p<0,05 по отношению к контрольным значениям; # - p<0,05 по отношению к значениям группы сравнения.
Изменения со стороны животных с ВУК касаются только: (NO)-X – рост и S – снижение. В дальнейшие сроки исследования в подгруппе НУК достоверное снижение сохраняется, начиная с 14, 21 суток исследования: (NO)-X до 28 суток, Imax, tgα, S сохраняется до 35 суток исследования, МДА – до 60-х суток эксперимента (табл. 2).
Таблица 2
Динамика tgα и S в эксперименте
Сутки |
Группа сравнения |
Экспериментальная группа |
||||||
tgα |
S |
tgα |
S |
|||||
ВУК |
НУК |
ВУК |
НУК |
ВУК |
НУК |
ВУК |
НУК |
|
0 |
0,21±0,02 |
0,23±0,02 |
1012,9±81,2 |
1110,5±86,9 |
- |
- |
- |
- |
1 с |
0,20±0,02 |
0,16±0,01* |
530,7±43,4* |
391,2±30,2* |
- |
- |
- |
- |
6 с |
0,19±0,02 |
0,12±0,01* |
681±53,1* |
382,4±34,2* |
- |
- |
- |
- |
8 с |
0,21±0,02 |
0,18±0,02* |
848,5±81,7* |
598,1±57,9* |
0,19±0,02 |
0,12±0,01# |
681±59,7# |
382,4±35,7# |
14 с |
0,18±0,01 |
0,19±0,02 |
675,5±59,6* |
752,7±69,5* |
0,19±0,01 |
0,18±0,02 |
772,5±68,9 |
489,3±44,9# |
21 с |
0,19±0,02 |
0,18±0,01* |
673,7±57,2* |
705,1±55,37* |
0,15±0,01 |
0,2±0,02 |
566,4±52,5 |
850,2±82,6# |
28 с |
0,27±0,02* |
0,18±0,02* |
762,9±74,5 |
605,8±55,9* |
0,26±0,02 |
0,19±0,02 |
785,7±62,5 |
723,8±59,8# |
35 с |
0,18±0,02 |
0,15±0,01* |
649,7±55,8* |
516,2±44,6* |
0,23±0,02# |
0,21±0,02# |
913,3±73,4# |
772,2±64,9# |
60 с |
0,23±0,02 |
0,24±0,02 |
1206,7±96,9 |
1142,8±104,0 |
0,19±0,02# |
0,21±0,02 |
705,5±65,2# |
930,4±78,2# |
90 с |
0,24±0,02 |
0,23±0,02 |
1158,7±99,4 |
1135,4±92,45 |
0,24±0,02 |
0,21±0,02 |
1185,7±103,4 |
1198,7±95,32 |
Примечание. * - p<0,05 по отношению к контрольным значениям; # - p<0,05 по отношению к значениям группы сравнения.
У животных с ВУК изменения параметров менее выражены: статистически значимо высокие значения NO-X сохраняются только на 14-е сутки исследования, а сниженные по отношению к контрольным показателям значения S – на протяжении 14, 21, 28, 35 суток после операции. Кроме того, в подгруппе животных с ВУК на 28-е сутки исследования статистически значимо возрастает tgα и Imax. Поздние сроки после операции, после предшествующей стабилизации большинства показателей на цифрах, близких к значениям интактных животных, характеризуются повторным нарастанием изменений, во многом повторяющих динамику ранних сроков после операции.
В подгруппе НУК 60-е и 90-е сутки исследования отмечены ростом LC по отношению к показателям интактных животных, которому предшествует значительный достоверный рост (NO)-X на 28-е сутки исследования, который на 90-е сутки сменяется снижением ниже показателей интактных животных. Также на 90-е сутки в этой подгруппе достоверно возрастает МДА, другие показатели от показателей интактных животных достоверных отличий не имеют (табл. 3). В подгруппе с ВУК 60-е сутки также отмечены достоверным ростом LC по отношению к показателям интактных животных, которому предшествует значительный рост (NO)-X на 28-е сутки исследования. Однако в отличие от НУК этот рост менее выражен и на 60-е и 90-е сутки сменяется более значительным снижением (NO)-X, ниже показателей интактных животных. Так же как и в подгруппе НУК, на 90-е сутки у животных с ВУК достоверно возрастает МДА.
Таблица 3
Динамика МДА и Imax в эксперименте
Сут ки
|
Группа сравнения |
Экспериментальная группа |
||||||
МДА |
Imax |
МДА |
Imax |
|||||
ВУК |
НУК |
ВУК |
НУК |
ВУК |
НУК |
ВУК |
НУК |
|
0 |
1,7±0,1 |
1,9±0,1 |
5,8±0,52 |
6,22±0,51 |
- |
- |
- |
- |
1 |
1,6±0,6 |
2,7±1* |
5,57±0,47 |
4,3±0,4** |
- |
- |
- |
- |
6 |
1,4±0,1* |
1,3±0,1* |
4,85±0,41 |
3,11±0,27* |
- |
- |
- |
- |
8 |
1,4±0,1* |
1,5±0,1** |
5,53±0,43 |
4,65±0,45* |
1,9±0,2# |
1,3±0,1# |
4,85±0,42 |
3,11±0,29# |
14 |
1,7±0,5 |
1,1±0,3* |
4,7±0,46* |
5,27±0,43* |
1,2±0,1# |
1,7±0,2# |
5,23±0,44 |
4,75±0,4 |
21 |
1,6±0,2 |
1,3±0,2* |
5,23±0,44 |
5,01±0,39* |
1,3±0,1# |
1,3±0,1 |
3,98±0,39# |
5,38±0,52 |
28 |
1,7±0,5 |
1,1±0,3* |
7,53±0,59* |
4,87±0,42* |
1,4±0,1 |
1,4±0,1 |
7,12±0,57 |
5,29±0,45 |
35 |
1,3±0,1* |
1,2±0,1* |
4,91±0,46 |
4,07±0,31* |
1,1±0,1# |
1,5±0,1# |
6,38±0,51# |
5,65±0,54# |
60 |
1,3±0,1* |
1,5±0,1* |
6,34±0,6 |
6,7±0,67 |
1,3±0,1 |
1,5±0,1 |
5,26±0,47# |
5,74±0,46# |
90 |
2,9±0,1 |
3,0±0,1* |
6,58±0,65 |
6,22±0,52 |
1,9±0,2# |
1,7±0,2# |
6,73±0,67 |
5,79±0,48 |
Примечание. * - p <0,05 по отношению к контрольным значениям; # - p <0,05 по отношению к значениям группы сравнения.
При воздействии 15-минутной ежедневной физической нагрузки в экспериментальной группе (8-е сутки исследования) снижение S отмечается в обеих подгруппах. Это достигается альтернативными вариантами изменений оксидантного профиля. В подгруппе животных с НУК по отношению к показателям группы сравнения отмечен статистически значимый рост LC, снижение tgα, МДА, Imax. В подгруппе животных с ВУК повышается (NO)-X и МДА. Статистически значимое снижение S относительно показателей группы сравнения в обеих экспериментальных подгруппах сохраняется только в первые сутки влияния физической нагрузки. В дальнейшем достоверные отклонения S характерны только для подгруппы животных с НУК: в 14-е сутки эксперимента она еще остается сниженной по отношению к показателям группы сравнения, а на 21, 28, и 35-е сутки исследования статистически значимо превышает показатели группы сравнения. Аналогичный рост S в подгруппе животных с ВУК отмечен только на 35-е сутки исследования. Также в обеих подгруппах на 21-е сутки исследования отмечен достоверный рост LC и Imax.
На 35-е сутки в обеих подгруппах значительно достоверно снижен (NO)-X, особенно в подгруппе с НУК. Фактически ежедневное влияние кратковременной нагрузки выравнивает динамику этого показателя, который в группе сравнения принимает максимальные значения за все время эксперимента. На 35-е сутки эксперимента достоверно увеличен по отношению к показателям группы сравнения tgα, однако в подгруппе животных с ВУК отмечен только на 35-е сутки исследования, за этим подъемом на 60-е сутки следует достоверное снижение указанного параметра, чего не наблюдается в подгруппе животных с НУК. Спустя 90 суток исследования МДА и (NO)-X статистически значимо снижены в обеих изучаемых подгруппах, однако значения показателя LC аналогичны таковому группы сравнения. Этому снижению на 60-е сутки исследования у животных с ВУК предшествует достоверный рост (NO)-X, а у животных с НУК – снижение. Также на 60-е сутки исследования по отношению к показателям группы сравнения в обеих подгруппах животных статистически значимо снижено S и Imax. Для подгруппы животных с ВУК характерен существенный рост tgα на 35-е сутки с последующим снижением на 60-е по отношению к показателям группы сравнения.
Проведенный корреляционный анализ в нашем исследовании выявил сильную положительную связь динамики маркеров перекисного окисления липидов (ПОЛ) и антиоксидантной системы (АОС) как у крыс с ВУК (S и tgα, 0,99), так и у крыс НУК (I max и tgα, 1,00; S и Imax, 0,95; S и tgα, 0,95). Сильная положительная корреляционная связь между МДА и показателями ПОЛ и АОС проявляется только при физической нагрузке у крыс с низким уровнем когнитивных способностей (МДА и Imax, 0,68; МДА и tgα, 0,69; МДА и S, 0,67). Статистически значимая отрицательная связь между содержанием нитритов и интенсивностью ПОЛ (NO-X и S, -0,64) отмечается в группе сравнения крыс с ВУК. Статистически значимая сильная отрицательная корреляционная связь между содержанием цитруллина – продукта NOS-реакции и нитритов (LC и NO-X, -0,7) у крыс с ВУК при физической нагрузке свидетельствует о возможном ингибировании продукции NO в ходе NOS-реакции и активации нитритредуктазной компоненты цикла окиси азота.
Статистически значимая отрицательная связь между (NO)-X и I max в группе сравнения крыс с ВУК, по-видимому, свидетельствует о его нейропротективном действии, так как известны антиоксидантные свойства оксида азота, которые препятствуют процессам перекисного окисления липидов, в частности нейтрализуя супероксид-аниона. Статистически значимых положительных корреляционных связей между показателями обмена оксида азота и свободнорадикальных процессов у крыс с НУК не наблюдалось ни в отсутствии физической нагрузки, ни с физической нагрузкой. Это, по-видимому, свидетельствует об отсутствии компенсаторного действия оксида азота, что подтверждается результатами увеличения МДА, т.е. развития окислительного стресса в этой группе.
Статистически значимая отрицательная зависимость между содержанием цитруллина - продукта NOS-реакции и нитритов у крыс с ВУК при физической нагрузке свидетельствует о возможном ингибировании продукции NO в ходе NOS-реакции и активации нитритредуктазной компоненты цикла окиси азота. В ранний период церебральной гипоперфузии усиленное образование NO может соответствовать адаптационно-компенсаторным механизмам в нейронах, направленным на использование его в качестве протектора гипоксии. Цикл окиси азота обеспечивает не только генерацию NO, но и эффективную элиминацию высокореакционноспособных свободнорадикальных соединений при помощи превращения в менее активные вещества, например в нитрит- и нитрат-ионы. Вместе с тем существует опасение, что при церебральной гипоксии увеличение акцептирования электронов ионами NO2- с цепи переноса электронов может усугубить нарушение окислительных энергетических процессов, превращая компенсаторный механизм в патологический [5].
В наших исследованиях ВУК у животных был ассоциирован с большим повреждением структур нейроглиального ансамбля после двусторонней перевязки обеих сонных артерий [6], а также с большей смертностью [7]. Выше показано, что у животных с ВУК существует сопряженность между интенсивностью перекисного окисления липидов и уровнем нитратов (отрицательная корреляционная связь), это позволяет предположить связь гибели животных с ВУК с экспрессией NO-синтазы, рост активности которой, как и смертность, приходится на 3-4 неделю развития церебральной гипоперфузии [8].
Полученные нами данные позволяют предполагать большую эффективность коррекции последствий когнитивного снижения при церебральной гипоперфузии донаторами азота у пациентов с высоким уровнем когнитивных функций. Вместе с тем у пациентов с низкими исходными показателями когнитивных функций более эффективными могут оказаться антиоксиданты. Продемонстрированные выше закономерности, полученные в нашем исследовании на животных, для успешного внедрения в практику требуют дальнейших клинических исследований.
Заключение
Физические нагрузки при гипоксии мозга у крыс с НУК приводят к окислительному стрессу. Продукция оксида азота у крыс с ВУК в условиях гипоксии носит компенсаторный нейропротективный характер. Активация нитритредуктазной компоненты цикла окиси азота при физических нагрузках у животных с ВУК является, по-видимому, локальной стресс-лимитирующей реакцией в условиях гипоксии мозга.