Рак легких является ведущей причиной смерти от онкологических заболеваний в мире. В структуре общей заболеваемости злокачественными новообразованиями в Российской Федерации рак легких входит в тройку ведущих, а среди мужского населения занимает первое место (17,6%). Ежегодно регистрируется более 60000 первичных случаев рака легкого. Немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ) составляет 80% всех случаев рака легких [1].
Лучевая терапия является основным методом лечения злокачественных заболеваний, однако НМРЛ часто обладает высокой радиорезистентностью, что создает серьезное препятствие в лечении опухоли [2]. Лучевая терапия в основном элиминирует чувствительные клетки, оставляя устойчивые к радиотерапии, которые затем могут вызвать рецидив опухоли и метастазирование. Частота местных рецидивов НМРЛ через 2 года после традиционной фракционированной лучевой терапии достигает 60–70% [3].
Одним из способов преодоления радиорезистентности является использование лучевой терапии высокой мощности ионизирующего излучения, которое применяется при стереотаксической радиохирургии и стереотаксической лучевой терапии экстракраниальных образований. По данным проспективных исследований, при стереотаксической лучевой терапии экстракраниальных образований НМРЛ I стадии 3-летний локальный контроль составил примерно 90% [4]. Имеющиеся клинические данные подтверждают высокую эффективность радиохирургии в достижении высокого локального контроля метастазов в головном мозге [5].
Недавние исследования показали, что микроРНК участвуют в реализации механизмов опухолевой радиорезистентности. МикроРНК представляют собой класс коротких нуклеотидных последовательностей (21–27 нуклеотидов) РНК, не принимающих участия в синтезе белка, но участвующих в транскрипционной и посттранскипционной регуляции экспрессии генов. Аберрантная экспрессия микроРНК была идентифицирована при многих злокачественных новообразованиях, в том числе НМРЛ [6; 7]. Исследования in vitro продемонстрировали, что чувствительность или устойчивость к ионизирующей радиации может изменяться в зависимости от увеличения или снижения экспрессии конкретных микроРНК. Идентификация молекулярных механизмов, лежащих в основе развития радиорезистентности при участии микроРНК, может значительно расширить арсенал терапевтических подходов, что позволит повысить радиочувствительность или ограничить радиорезистентность опухоли, тем самым оказывая более значимые клинические эффекты в ответ на лучевую терапию пациентов с НМРЛ [7].
Цель исследования: оценить влияние воздействии радиохирургических доз ионизирующего излучения с исследованием дифференциальной экспрессии микроРНК при воздействии радиохирургических доз ионизирующего излучения в культуре клеток немелкоклеточного рака легкого H1299.
Материалы и методы исследования
Исследование проводили на культуре клеток немелкоклеточного рака легкого Н1299. Клеточную линию пассировали во флаконы Т25 см2 (Corning, USA) по 10×106 клеток в питательную среду DMEM (Gibco, USA), с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки («Биолот», Россия), 1% раствора пенициллина-стрептомицина («Биолот», Россия), 1% незаменимых аминокислот (Gibco, USA), 1% Glutamax (Gibco, USA). Перед облучением клеточную линию культивировали 24 часа в инкубаторе Binder (Германия) при 37 °C, 5% СО2. После инкубации декантировали полную питательную среду и вносили DMEM без сыворотки, антибиотиков и добавок. Клетки облучали на линейном ускорителе NovalisTx (Varian, USA) с воздействием доз радиации в диапазоне от 18 до 24 Гр с шагом 1 Гр в 3 повторах. Контрольную группу оставляли без облучения. Экспозиция клеточной линии после воздействия радиации составляла 24 ч в инкубаторе при 37°C, 5% СО2. Снятие клеток проводили по стандартной методике раствором трипсин-версена («Биолот», Россия) 1:1. Долю клеток, находящихся на различных стадиях апоптоза, оценивали на проточном цитофлуориметре FACSCantoII (BD, США) с использованием Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (BD, США).
Выделение тотальной РНК проводили с использованием автоматической станции QIAcube Connect (Qiagen, Германия) и набора RNeasy Mini Kit (Qiagen, Германия). Оценку относительной экспрессии микроРНК проводили по стандартной методике [6]. Зрелые микроРНК, присутствующие в общей РНК (200 нг), сначала полиаденилировали в общем объеме 10 мкл, содержащем 1 мкл 10-кратного поли(А)-полимеразного буфера, 1 мкл 10 мМ АТФ, 2,5 единицы поли(А)-полимеразы. (New England Biolabs, США) в течение 30 мин. при 37°C. Полиаденилированные микроРНК подвергали обратной транскрипции с использованием универсального обратного праймера, который содержит олиго(dT)-последовательность и адаптерную последовательность на 5'-конце. К реакционной смеси (10 мкл) добавляли 4 мкл 5 × RT буфера, 1 мкл 25 мМ dNTP, 1 мкл 10 мкМ универсального праймера. и 200 единиц обратной транскриптазы M-MuLV («Евроген», Российская Федерация) и доводили объем до 20 мкл водой, свободной от нуклеаз. Обратную транскрипцию проводили при 42°C в течение 45 минут с последующей инкубацией при 85°C в течение 5 минут для инактивации обратной транскриптазы. Полученную таким образом комплементарную ДНК (кДНК) разбавляли в 10 раз водой, свободной от РНКаз. 5 мкл разведенной кДНК использовали в реакциях ПЦР-РВ. ПЦР-микс содержал 10х реакционный буфер, 200 нМ dNTP, 1x EvaGreen, 1 ед HSTaqPol («Евроген», Российская Федерация), 250нМ прямого и обратного праймера. ПЦР-РВ проводили в системе для ПЦР CFX96 (Bio-Rad, США) при следующих условиях: начальная денатурация при 95°C в течение 3 минут с последующими 40 циклами денатурации (95°C в течение 10 секунд), отжига (60°C в течение 30 секунд) и элонгации (72°C в течение 30 секунд). Специфичность праймеров оценивалась с помощью плавления продуктов ПЦР при диапазоне температур 60-95°C. Использовалась опция автоматического порога для получения значений Ct. Для оценки изменения относительной экспрессии микроРНК использовался метод 2-ΔΔ Ct. В качестве референсной РНК использовалась RNU47. Данные ПЦР-РВ представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение. Статистическая значимость определялась с помощью ANOVA и теста Тьюки. Межгрупповые различия рассматривали как статистически значимые при р <0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
Стереотаксическая лучевая терапия в радиохирургических режимах обеспечивает высокие дозы гомогенно распределённого ионизирующего излучения в опухолевых тканях, вызывая радиационно-индуцированный апоптоз, который является важнейшим фактором, обеспечивающим эффективность лучевой терапии [2].
Определение эффективности воздействия радиохирургических доз ионизующего излучения заключалось в исследовании апоптоза в культуре клеток НМРЛ H1299, на которые было оказано воздействие доз радиации в диапазоне от 18 до 24 Гр с шагом 1 Гр (рис. 1).
Рис. 1. Процент клеток немелкоклеточного рака легкого H1299, находящихся на разных стадиях радиационно-индуцированного апоптоза. Q1-1 - мертвые клетки; Q2-1 - ранний апоптоз; Q3-1 - живые клетки; Q4-1 - поздний апоптоз
При автоматическом подсчете живых клеток наименьшее количество живых клеток наблюдается при суммарной очаговой дозе от 22 до 24 Гр (4,5-4,6 х 106), также отмечается значительное уменьшение количества живых клеток в группах с облучением по сравнению с контрольной группой. При оценке количества клеток, находящихся на стадиях раннего и позднего апоптоза, установлено, что процент клеток, находящихся на ранней стадии апоптоза, наибольший в группе с очаговой дозой 24 Гр (5,7%), что на 2,7% больше, чем в контрольной группе. Анализ данных о количестве клеток, находящихся на поздней стадии апоптоза, показал, что наибольший эффект наблюдался в диапазоне доз ионизирующего излучения от 21 до 24 Гр.
Другим методом оценки эффективности терапии на ионизирующее излучение была выбрана оценка экспрессии микроРНК. Исследования последних лет показали, что изменяющаяся под действием ионизирующего излучения экспрессия микроРНК может оказывать влияние на результат радиотерапии. Методом RT-qPCR была проведена оценка изменения экспрессии микроРНК hsa-miR-15a-5p, hsa- miR-16a-5p, hsa-miR-17-3p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-145-5p, hsa-miR-663 в культуре клеток немелкоклеточного рака легкого Н1299 при воздействии ионизирующего излучения в диапазоне от 18 до 24 Гр с шагом 1 Гр. Отмечены следующие изменения экспрессии: miR-16a-5p – повышение экспрессии по сравнению с контрольной группой в 4,9 раза (p=0.0096), miR-21-5p - повышение экспрессии по сравнению с контрольной группой в среднем в 13 раз (p=0.05), miR-663 - снижение экспрессии по сравнению с контрольной группой в среднем в 2,8 раза (p=0.00011). Однако значимых отличий в экспрессии микроРНК между экспериментальными группами, подвергнувшимися воздействию радиохирургических доз ионизирующей радиации, выявлено не было (рис. 2).
Рис. 2. Изменение относительной экспрессии микроРНК miR-16a-5p (А), miR-21-5p (Б) и miR-663 (В)
Основная функция микроРНК заключается в эпигенетической регуляции экспрессии генов. В литературе подчеркивается, что микроРНК регулируют апоптоз на разных уровнях. Предполагается возможность селективно контролировать гибель клеток посредством изменения экспрессии микроРНК [7].
Семейство miR-15, включая miR-15a, miR-15b и miR-16, оказывает влияние на радиочувствительность различных опухолей человека, таких как рак груди, рак шейки матки и НМРЛ [8; 9] При НМРЛ происходит повышение экспрессии hsa-miR-16-5p, что значительно подавляет жизнеспособность клеток и усиливает апоптоз, тогда как ингибиторы hsa-miR-16-5p оказывают противоположный эффект [10].
Экспрессия микроРНК hsa-miR-663 снижается при воздействии радиохирургических доз ионизирующего излучения. В исследовании Zhi-Yong L. et al. было показано, что hsa-miR-663 высоко экспрессируется у пациентов с раком легких. hsa-miR-663 влияет на пролиферацию клеток рака легких, прямо или косвенно регулируя TGFB1, P53, Bax и Fas [11]. Дополнительно miR-663 регулирует апоптоз, влияя на проницаемость внешней митохондриальной мембраны посредством PUMA / BBC3 и BTG2 [12].
МикроРНК hsa-miR-21-5p сверхэкспрессируется практически во всех типах опухолей человека [13]. Следует отметить, что hsa-miR-21 активируется в резистентных к радиотерапии клетках НМРЛ по сравнению с радиочувствительными аналогами [14]. Подавление hsa-miR-21-5p в радиорезистентных клетках НМРЛ A549 снижает колониеобразующую способность и пролиферацию после воздействия ионизирующего излучения. Более того, подавление hsa-miR-21-5p усиливает индуцированный радиацией апоптоз клеток A549 [15]. Дальнейший анализ мишеней hsa-miR-21-5p представляет значительный интерес, поскольку они могут выявить новые стратегии лучевой сенсибилизации для радиорезистентного НМРЛ.
Заключение
Эффективность лучевой терапии зависит от радиочувствительности опухоли. При наличии повреждений ДНК, вызванных действием ионизирующей радиации, и нарушении репарации происходит элиминация поврежденной клетки путем апоптоза. К сожалению, опухолевые клетки уже имеют или могут приобрести радиорезистентные характеристики, которые позволяют им избежать гибели клеток. Выявленное изменение экспрессии микроРНК hsa-miR-16-5p, hsa-miR-21-5p и hsa-miR-663 при воздействии радиохирургических доз ионизирующего излучения в культуре клеток немелкоклеточного рака легкого H1299 может свидетельствовать об их возможном участии в ответе на радиационное воздействие.