Спонтанные аборты (СА) наблюдаются в 10–15% подтвержденных беременностей разных сроков [1 2]. Основной причиной СА первого триместра беременности в 50–70% являются хромосомные аномалии (ХА), среди которых преобладают численные нарушения (анеуплоидия и полиплоидия), встречающиеся в 92–97% случаев. Определение ХА в тканях СА проводится с 1960-х гг., т.е. с момента становления клинической цитогенетики [3, 4]. Определение кариотипа спонтанных абортусов необходимо для установления причин прерывания беременности, которое может помочь в генетическом и репродуктивном прогнозе данной семьи. Анализ кариотипа абортусов обычно осуществляется при цитогенетическом и молекулярно-цитогенетическом исследованиях хромосомных препаратов, полученных из культивированных или некультивированных клеток ворсин хориона. Цитогенетический метод исследования материала СА часто сопряжен с некоторыми проблемами, среди них – неудачи в получении хромосомных препаратов, контаминация материнскими клетками при культивировании, нарушение процесса деления аномальных клеток [5, 6]. Эти трудности могут быть успешно преодолены с использованием таких молекулярно-цитогенетических технологий, как флюоресцентная гибридизация in situ (FISH). FISH-метод позволяет проводить анализ ХА на интерфазных ядрах, минуя этапы получения хромосомных препаратов. При этом быстрый и эффективный анализ возможен на клетках практически всех тканей [7–10]. Одним из преимуществ интерфазной FISH является возможность выявления «скрытого» хромосомного мозаицизма благодаря анализу большого числа клеток, в отличие от стандартного цитогенетического исследования, при котором анализируется небольшое количество метафазных пластин. В связи с этим при анализе материала спонтанных абортов цитогенетическим методом выявляемость хромосомного мозаицизма крайне низка, хотя известно, что на ранних стадиях дробления зиготы хромосомный мозаицизм наблюдается с высокой частотой, что было доказано рядом исследований преимплантационных эмбрионов [11]. Известно также, что мутации хромосом в виде численных аномалий в зародышевых клетках ведут к образованию аберрантных гамет, в результате которых возможна гибель зигот, эмбрионов на ранних стадиях внутриутробного развития. Кроме того, последние исследования отмечают значительную этиологическую роль хромосомного мозаицизма, который представляет хромосомную нестабильность как в нарушении психического развития, так и в нарушении эмбрионального развития [12–15].
Можно предположить, что роль хромосомного мозаицизма в эмбриональном развитии не оценена в полной мере из-за анализа малого числа клеток при стандартном кариотипировании. Таким образом, флюоресцентная гибридизация in situ (FISH) является более информативным методом для обнаружения мозаичных форм хромосомных аномалий, в том числе мозаицизма низкого уровня, что будет способствовать эффективному определению доли аномальных клеток и в дальнейшем – корректному медико-генетическому консультированию семей, отягощенных хромосомными болезнями и аномалиями. Мы представляем результаты FISH-исследования клеток от 1333 спонтанных абортусов первого триместра беременности с применением прицентромерных ДНК-зондов.
Материалы и методы исследования
Проведено FISH-исследование 1333 образцов материала СА первого триместра беременности (средний срок 8,1 недели). Средний возраст женщин составлял 31,9 года. Соотношение полов (мужской/женский) общего количества образцов СА (n=1333) составило 468/865 (0,54). Материалом для исследования СА являлись клетки ворсинчатого хориона или амниотической оболочки. Препараты некультивированных интерфазных клеток готовили по оригинальной, специально разработанной методике [16–18]. FISH-исследования осуществлялись с использованием ДНК проб из коллекции лаборатории цитогенетики и геномики психических заболеваний ФГБНУ НЦПЗ по ранее описанным протоколам [10, 19]. Использовались прицентромерные ДНК пробы на хромосомы: 9, 13/21, 14/22 (общие для пар хромосом 13 и 21, 14 и 22), 15, 16, 18, Х и Y для выявления численных ХА. ДНК пробы, помеченные различным цветом, были сгруппированы парами для большей эффективности. Анализировали не менее 200 интерфазных клеток для каждой ДНК пробы. Мозаицизм учитывался от 5% аномальных клеток и более. Статистическая обработка проводилась согласно стандартным методикам анализа массива цитогенетических данных в соответствии с ранее описанными протоколами [17, 18]. Это исследование было одобрено этическим комитетом ОСП «Научно-исследовательский клинический институт педиатрии им. академика Ю.Е. Вельтищева» ФГАОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздрава России.
Результаты исследования и их обсуждение
В результате интерфазного FISH-исследования клеток образцов материала 1333 СА (средний срок беременности 8,1 недели) с использованием ДНК проб на хромосомы 9, 13/21, 14/22, 15, 16, 18, Х и Y численные ХА выявлены в 603 из 1333 образцов СА (45,2%), из которых 555 (41,6%) случаев были с одной ХА (анеуплоидией или полиплоидией) и 48 (3,6%) – с сочетанием двух и более ХА (рис. 1). Средний возраст женщин в исследовании составлял 31,9 года. В группе с двумя и более ХА средний возраст женщин был несколько выше – 34,1 года, что согласуется с данными других публикаций [17, 18, 20].
Рис. 1. Результаты FISH-исследования 1333 образцов СА
Рис. 2. Структура патологии с одной ХА среди CA (n=555)
Структура хромосомной патологии среди всех случаев с одной ХА была следующей: анеуплоидия аутосом была обнаружена в 304 образцах (54,8% от образцов с одной ХА, n=555), анеуплоидия гоносом – в 130 образцах (23,4%), полиплоидия – в 121 образце (21,8%) (рис. 2).
Среди случаев анеуплоидии аутосом (n=304) были обнаружены трисомии – в 274 образцах (90,1%), моносомии – в 30 образцах (9,9%). Трисомия аутосом встречалась среди следующих хромосом (рис. 3): 16 – в 119 образцах (43,4%), 14/22 – в 60 (21,9%), 13/21 – в 32 (11,7%), 15 – в 30 (10,9%), 9 – в 18 (6,6%), 18 – в 15 (5,5%). Среди моносомий наиболее часто, в 9 случаях (30,0%), наблюдалась моносомия хромосом 13/21, далее хромосомы 15 – в 8 (26,7%) случаях, хромосом 14/22 – в 5 (16,6%) случаях, хромосомы 18 – в 4 (13,3%) случаях, хромосом 9 и 16 – по 2 (6,7%) случая (рис. 3). Мозаичная анеуплоидия аутосом встречалась в 145 образцах, что составило 47,7% от всех случаев анеуплоидии аутосом. Результаты выявления регулярных и мозаичных случаев анеуплоидии аутосом представлены в таблице.
Рис. 3. Анализ ХА по анеуплоидии аутосом
Анализ регулярных и мозаичных форм анеуплоидии аутосом по разным хромосомам
|
Хромосома |
Трисомия |
Моносомия |
||
|
Регулярная |
Мозаичная |
регулярная |
мозаичная |
|
|
16 |
82 |
37 |
1 |
1 |
|
13/21 |
14 |
18 |
9 |
– |
|
14/22 |
19 |
41 |
2 |
3 |
|
9 |
10 |
8 |
1 |
1 |
|
15 |
12 |
18 |
4 |
4 |
|
18 |
5 |
10 |
– |
4 |
|
Итого |
142 |
132 |
17 |
13 |
По данным литературы, среди регулярной трисомии аутосом наиболее часто выявляется трисомия хромосомы 16, второй по частоте следует трисомия хромосом 14/22, несколько реже – трисомии хромосом 13/21, 15 и 18, остальные аутосомы вовлечены в трисомию при СА в меньшей степени. Наши результаты совпадают с данными литературы [5, 6, 20]. Мозаичные формы трисомии преобладали по аутосомам 14/22, 13/21, 15, 18 и составляли более половины случаев трисомии по этим хромосомам, как видно из таблицы. Моносомии аутосом наблюдались значительно реже. Наиболее часто встречалась моносомия хромосом 13/21 и 15 (табл.).
Анеуплоидия гоносом наблюдалась в 130 образцах с одной ХА (n=555) (23,4%) и в большинстве случаев была представлена хромосомой Х. Среди этих 130 случаев регулярная моносомия с участием хромосомы Х была обнаружена в 44 образцах (33,8%), регулярная дополнительная хромосома Х – в 11 образцах (8,5%). Мозаичная анеуплоидия гоносом наблюдалась в 75 образцах (57,7%) (рис. 4a). В литературе часто упоминается о регулярной моносомии хромосомы Х в материале СА и редко – о мозаичной анеуплоидии хромосомы Х. В нашем исследовании более половины случаев анеуплоидии с участием хромосомы Х (57,7%) встречались в мозаичной форме (рис. 4а), что указывает на частые ошибки в митотическом расхождении с участием хромосомы Х, описанные ранее разными авторами [21–23].
Рис. 4. Анализ анеуплоидии гоносом и полиплоидии: а – анеуплоидия гоносом;б – полиплоидия
Полиплоидия была обнаружена в 121 образце (21,8%). Регулярная триплоидия (3n) выявлена в 64 из 121 образца (52,9%), регулярная тетраплоидия (4n) – в 9 образцах (7,4%), мозаичная полиплоидия, представленная мозаицизмом 3n/4n/2n, 3n/2n и 4n/2n, наблюдалась в 48 образцах, что составило 39,7% от всех случаев полиплоидии (рис. 4б). По данным других авторов, полиплоидия наблюдается в материале СА с высокой частотой (21,5%), среди которой преобладает триплоидия (до 17%). Тетраплоидия встречается реже – с частотой до 9% [20, 24]. В нашем исследовании регулярная триплоидия встречалась во много раз чаще тетраплоидии (64/9), однако мозаичная полиплоидия была обнаружена в представленных случаях с высокой частотой (39,7%), что не описано в литературе.
Среди случаев сочетания двух и более ХА в одном образце (n=48) наиболее часто встречались мозаичные формы ХА, которые были выявлены в 41 случае, что составило 85,4% из всех сочетанных случаев. В анеуплоидиях этой группы участвовали следующие аутосомы: хромосома 16, хромосомы 13/21 и 14/22, хромосомы 18, 15 и 9. Анеуплоидия хромосомы Х в сочетанных случаях встречалась в 22 образцах, причем в 21 образце – в мозаичной форме, что свидетельствует о высокой частоте постзиготического нерасхождения хромосомы Х, о чем упоминалось выше при обсуждении анеуплоидии гоносом. Если суммировать мозаичную анеуплоидию хромосомы Х в образцах с одиночной и сочетанной ХА, то мозаичные формы анеуплоидии хромосомы Х составляют 16,1% от всех ХА (n=603), что значительно выше, чем во всех других сообщениях по СА [6, 8, 20, 24]. В случаях с двумя и более ХА полиплоидия выявлена в 9 образцах. Примеры результатов FISH-исследований представлены на рисунках 5 и 6.
Рис. 5. Результаты интерфазного FISH-исследования образцов СА (исследуемые хромосомы указаны в верхнем левом углу каждой фотографии в соответствии с цветом ДНК пробы): а) мозаичная трисомия хромосомы 16; б) мозаичная трисомия хромосом 14/22;
в) триплоидия; г) тетраплоидия
Рис. 6. Результаты интерфазного FISH-исследования образца СА сроком 6–8 недель с трисомией по хромосомам 15, 13/21, 14/22 (исследуемые хромосомы указаны в верхнем левом углу каждой фотографии в соответствии с цветом ДНК пробы):
а) трисомия хромосом 13/21, б) трисомия хромосом 15 и 14/22
Соотношение полов (мужской/женский) общего числа образцов СА (n=1333) составило 468/865 (0,54). Преобладание женского пола, вероятно, связано с тем, что при исследовании материала СА могла произойти некоторая контаминация и, возможно, в отдельных случаях анализированы и материнские клетки. Среди образцов с хромосомными аномалиями соотношение полов (мужской/женский) составило 230/373 (0,62), т.е. женский пол также значительно преобладал. Возможно, эмбрионы мужского пола с ХА элиминируются на более ранних сроках беременности, поэтому в соотношении полов с ХА преобладает женский пол [17, 18]. При анализе соотношения полов при регулярных и мозаичных формах хромосомных аномалий также наблюдалось преобладание женского пола, причем в мозаичных случаях больше, чем в регулярных (рис. 7). Учитывая тот факт, что мозаичная анеуплоидия хромосомы Х наблюдалась в большом числе случаев у абортусов женского пола, был проведен анализ соотношения полов при мозаичных формах анеуплоидии аутосом и полиплоидии (без анеуплоидии хромосомы Х), который также показал преобладание женского пола. Результаты анализа соотношения полов по различным хромосомным аномалиям представлены на рисунках 8 и 9.
Рис. 7. Анализ соотношения полов среди случаев с ХА: а – все ХА (n=603); б – регулярные ХА; в – мозаичные ХА; г – мозаичные ХА без анеуплоидии хромосомы Х
Рис. 8. Анализ соотношения полов по анеуплоидии различных аутосом
Рис. 9. Анализ соотношения полов по анеуплоидии хромосомы Х,полиплоидии и сочетанных ХА
При анализе соотношения полов по анеуплоидии различных аутосом, среди которой выявлены как регулярные, так и мозаичные случаи, преобладали абортусы, в основном, женского пола. В мозаичных анеуплоидиях всех исследуемых аутосом, кроме хромосомы 15, также преобладали эмбрионы женского пола (рис. 8).
Таким образом, среди всех случаев ХА (n=603) мозаичные формы ХА были обнаружены в 309 образцах, что составило 51,2%, или 23,2% от общего числа всех СА (n=1333). При этом мозаичная анеуплоидия аутосом встречалась в 145 образцах (47,7% от случаев анеуплоидии аутосом, n=304) (рис. 2), мозаичная анеуплоидия хромосомы Х наблюдалась в 75 образцах (57,7% от одиночных случаев анеуплоидии гоносом, n=130) (рис. 4а), мозаичная полиплоидия наблюдалась в 48 образцах (39,7% от случаев полиплоидии, n=121) (рис. 4б), мозаичные формы сочетанных ХА присутствовали в 41 образце (85,4% сочетанных случаев, n=48). Наши оригинальные данные по частоте мозаицизма указывают на то, что и регулярные, и в большей степени мозаичные формы численных ХА являются значимой причиной СА. Исследования хромосомного мозаицизма с помощью метода FISH являются наиболее эффективными для выявления численных мозаичных форм ХА при СА и позволяют определить генетическую причину внутриутробной гибели плода, что будет способствовать более корректному медико-генетическому консультированию семьи, отягощенной наследственными (хромосомными) заболеваниями.
Заключение
В данной работе применение метода интерфазной FISH с использованием ДНК зондов на хромосомы 9, 15, 16, 18, 13/21, 14/22, Х и Y при исследовании численных ХА среди 1333 образцов СА первого триместра беременности позволило обнаружить, что мозаичные формы ХА составляли 23,2% от общего числа спонтанных абортусов (n=1333), или 51,2% от случаев с ХА (n=603). Эти данные согласуются с нашими предыдущими FISH-исследованиями СА, где показано, что мозаичные формы в материале СА встречались при анеуплоидии всех исследуемых аутосом, анеуплоидии хромосомы Х и полиплоидии с высокой частотой [17, 18]. Полученные данные, как демонстрируют наши зарубежные коллеги, имеют исключительное значение для изучения и диагностики хромосомных аномалий в клетках тканей плода [25, 26]. Таким образом, ошибки в митотическом расхождении хромосом, приводящие к мозаичным формам численных ХА, вероятно, являются одной из наиболее значимых генетических причин внутриутробной летальности плода. Исследования хромосомного мозаицизма с помощью метода FISH, который является наиболее эффективным для выявления численных ХА, как регулярных, так и мозаичных форм, смогут помочь в генетической интерпретации возможной причины внутриутробной гибели плода, что будет способствовать более корректной медико-генетической консультации семьи, отягощенной наследственными (хромосомными) заболеваниями.
Работа была поддержана ГОСЗАДАНИЕМ Минздрава России «Роль геномной нестабильности в этиологии и патогенезе недифференцированных форм умственной отсталости у детей» (№ 121031000238-1), а также Правительственным заданием Министерства науки и высшего образования России № AAAA-A19-119040490101-6.