Диагностика гломерулонефритов является актуальной проблемой современной медицины. Основным методом лабораторной диагностики клинико-морфологических форм гломерулонефрита является биопсия почки, которая сопровождается высокотравматическими процедурами. В качестве одного из малоинвазивных лабораторных методов диагностики гломерулонефритов предлагается метод сканирующей электронной и атомно-силовой микроскопии крови пациентов. Ранее нами были опубликованы научные работы, посвященные исследованию крови детей с заболеваниями почек, сопровождающимися гематурией, методами сканирующей электронной (СЭМ) и атомно-силовой микроскопии [1; 2]. Их результаты позволили сформировать гипотезу о наличии связи между клинической формой гломерулонефрита и как морфологии самих эритроцитов, так и обнаруженных на их поверхности наноразмерных частиц (НЧ) эндогенного происхождения. Для разработки нового метода, основанного на данных СЭМ крови, необходимо установление специфических морфологических характеристик эритроцитов у пациентов с различными клинико-морфологическими формами гломерулонефритов. Специфические различия могут послужить основой для разработки новых лабораторных методов для диагностики гломерулонефритов.
Цель настоящего исследования – изучение морфологических особенностей эритроцитов в крови у пациентки с верифицированным диагнозом хронического мезангиопролиферативного гломерулонефрита методом сканирующей электронной микроскопии в сравнении с данными пациентки с другой формой воспаления почек – хроническим тубулоинтерстициальным нефритом.
Материалы и методы исследования
Материалом исследования служили капиллярная кровь и моча двух пациенток – пациентки Г. с диагнозом хронического мезангиопролиферативного гломерулонефрита и пациентки К. с диагнозом хронического тубулоинтерстициального нефрита. Лабораторные работы выполнялись в Северо-Восточном федеральном университете имени М.К. Аммосова и получили одобрение Локального комитета по биомедицинской этике. Обе пациентки подписали информированное добровольное согласие на использование личных данных и биологического материала в научных целях.
Пациентка Г., 23 года, группа крови Aβ(II), Rh+, основное заболевание: хронический мезангиопролиферативный гломерулонефрит (ХМПГН). В январе 2018 года в условиях стационара пациентке была выполнена пункционная биопсия левой почки, по результатам световой микроскопии картина соответствовала мезангиопролиферативному гломерулонефриту (14 клубочков, 4 из них склерозированы).
Пациентка К., 24 года, группа крови Aβ(II), Rh+, основное заболевание: хронический тубулоинтерстициальный нефрит (ХТИН). Результаты обследования пациентки К. использовались для сравнения, как контрольные.
Для оценки функции почек был проведен общеклинический анализ мочи на автоматическом анализаторе и микроскопия мочевого осадка.
Мазки из капиллярной крови готовили на предметных стеклах, пользуясь шлифованным краем другого предметного стекла, затем высушивали на воздухе при комнатной температуре без их фиксации и окраски. Исследование мазков проводили методом СЭМ.
Метод сканирующей электронной микроскопии для получения изображения эритроцитов капиллярной крови. Исследование проведено с помощью сканирующего электронного микроскопа JEOL JSM-7800F (Япония) с разрешающей способностью 1,2 нм (при 1 кВ) с системой Gentle Beam в режиме низких ускоряющих напряжений (1-2 кВ) с параллельным использованием системы торможения пучка электронов [3]. Изображения изучались при увеличениях от 1000 до 40000 крат при фокусном расстоянии 3,7 мм. Данная методика повышает качество изображения и позволяет не наносить внешние проводящие покрытия на образцы крови [1; 2].
Результаты исследования и их обсуждение
В ходе исследования были получены СЭМ-изображения эритроцитов, по которым анализировались размеры (диаметры) эритроцитов и их количество, размеры и количество наночастиц (НЧ).
Отметим, что по результатам общеклинического анализа мочи у пациентки Г. (с ХМПГН) наблюдается слабо выраженная протеинурия и гематурия, а у пациентки К. (с ХТИН) - слабо выраженная протеинурия, эпителийурия, трипельфосфаты и более щелочная реакция мочи (табл.).
Общеклинический анализ мочи пациенток с микроскопией мочевого осадка
|
Свойства и материалы |
Пациентка Г. |
Пациентка К. |
|
цвет |
светло-желтый |
светло-желтый |
|
прозрачность |
неполная (слабо мутная) |
неполная (слабо мутная) |
|
количество |
50,0 |
30,0 |
|
плотность |
1,020 |
1,015 |
|
pH |
6,0 |
8,0 |
|
белок |
0,3 g/l |
0,1 g/l |
|
эритроциты |
250 RBC/ul |
- |
|
лейкоциты |
- |
- |
|
билирубин |
- |
- |
|
глюкоза |
- |
- |
|
уробилиноген |
- |
- |
|
мочевина |
1,6 umol |
1,6 umol |
|
кетоновые тела |
- |
- |
|
нитриты |
- |
- |
|
Микроскопическое исследование |
||
|
Эпителий: |
||
|
Плоский в п/зр |
4-0-1 |
скопл. |
|
Переходный |
- |
- |
|
Почечный |
- |
- |
|
Лейкоциты в п/зр |
2-3-1 |
2-3-5 |
|
Эритроциты: |
||
|
Измененные в п/зр |
2-3-5 |
- |
|
Неизмененные в п/зр |
25-26-27 |
- |
|
Цилиндры |
- |
- |
|
Слизь |
- |
- |
|
Бактерии |
- |
- |
|
Соли |
трипельфосфаты ++ |
|
|
Грибки |
- |
- |
На рисунке 1 представлены СЭМ-изображения поверхности эритроцитов капиллярной крови пациентки Г. (с ХМПГН). Размеры эритроцитов варьируются от 5 до 10 микрон, средний размер эритроцитов составил примерно 7,45±0,13 микрона. Для подсчета количества эритроцитов в связи с их линейными размерами были сформированы группы с шагом в 0,5 микрона. В соответствии с этим разделением наибольшее количество эритроцитов в поле зрения имело размер 6,5-7,0 микрон (рис. 2а). Для подсчета количества НЧ в связи с их размерами они были разделены на группы с шагом в 10 нм. НЧ, которые были выявлены у пациентки с ХМПГН на поверхности эритроцитов (визуализируются в виде белых включений на рис. 1), по размеру варьировали от 30 до 100 нм, максимальное количество НЧ имело размеры 30-40 нм (рис. 2б).
а) б)
в) г)
Рис. 1. СЭМ-изображения поверхности эритроцитов пациентки Г. (с ХМПГН) при увеличениях 1000 (а), 10 000 (б), 20 000 (в) и 40 000 (г) крат; НЧ визуализируются в виде включений белого цвета (в, г)
а) б)
Рис. 2. Пациентка Г. Диаграмма линейных размеров: а) СЭМ-изображений эритроцитов, б) НЧ на поверхности эритроцитов. Вертикальная ось – абсолютное количество в поле зрения, горизонтальная ось – размеры
СЭМ-изображения поверхности эритроцитов пациентки К. (с ХТИН) представлены на рисунке 3. Данные СЭМ-изображений ее крови свидетельствуют о том, что размеры эритроцитов варьируются от <5 до 9,5 микрон (средняя величина около 7,54±0,17 микрона). Максимальное количество эритроцитов характеризуется диаметром 7,0-7,5 микрон (рис. 4а). Отметим, что НЧ на поверхности эритроцитов у пациентки К. имеют размытые, хлопьеобразные формы, а размер НЧ варьируется от 40 до 200 нм (максимальное количество НЧ характеризуется размером в пределах от 80-90 и 100-200 нм) (рис. 4б).
а) б)
в) г)
Рис. 3. СЭМ-изображения поверхности эритроцитов пациентки К. при увеличениях 1100 (а), 10 000 (б), 20 000 (в) и 40 000 (г) крат; НЧ визуализируются в виде хлопьевидных светлых включений (в, г)
а) б)
Рис. 4. Пациентка К. Диаграмма линейных размеров: а) СЭМ-изображений эритроцитов, б) НЧ на поверхности эритроцитов (27.05.19 г.). Вертикальная ось – абсолютное количество в поле зрения, горизонтальная ось – размеры
Таким образом, установлено, что у пациентки с ХМПГН средние линейные размеры эритроцитов относительно меньше, при том что нижний и верхний пределы вариабельности размеров больше. Также выявлено, что эндогенные НЧ на поверхности эритроцитов у пациентки с ХМПГН имеют значительно меньшие размеры и более четкие изображения.
Конечно, для установления значимости связи обнаруженных специфических морфологических характеристик эритроцитов, а также НЧ с диагнозом ХМПГН необходимы дополнительные исследования с использованием других методов клинической лабораторной диагностики, как минимум проведение общего клинического анализа крови.
Однако, как нам представляется, именно особенности НЧ, их качественные и количественные характеристики в большей степени, чем морфологические характеристики эритроцитов, связаны с клинико-морфологической формой патологии почек, с ХМПГН.
Анализ размера НЧ, обнаруженных на поверхности эритроцитов, свидетельствует об их соответствии размерам экзосом [4-7]. В связи с этим возможно, что разница в размерах НЧ у двух пациенток обусловлена различиями биогенеза НЧ, которые могут быть ассоциированы с клинико-морфологической формой патологии почек. Известно, что на характеристики экзосом влияет редокс-статус [8], а экспрессия окислительных и антиоксидантных ферментов различна внутри разных типов клеток одного органа. Следовательно, редокс-статус может зависеть от морфологических и патогенетических особенностей локализации патологии в почках - в клубочках, канальцах и интерстиции [9].
Заключение
СЭМ с катодом Шоттки и системой Gentle Beam в режиме низких ускоряющих напряжений (1-2 кВ) с параллельным использованием системы торможения пучка электронов позволяет получить изображения эритроцитов без нанесения проводящих покрытий на образец. При проведении СЭМ мазков крови выявляются различия в морфологических характеристиках элементов крови – эритроцитах и НЧ на их поверхности. Выявленные особенности морфологических характеристик эритроцитов капиллярной крови и НЧ на их поверхности, вероятно, могут быть ассоциированы с диагнозом мезангиопролиферативного гломерулонефрита у пациентки. Это может явиться основой для разработки новых лабораторных методов в качестве альтернативы почечной биопсии для установления диагноза мезангиопролиферативного гломерулонефрита. Для подтверждения нашей гипотезы, конечно, нужно продолжение исследований. Данное исследование было инициальным, поэтому было решено опубликовать его результаты.