Scientific journal

Modern problems of science and education

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

Современные промышленные комплексы с мощной инфраструктурой по переработке нефти и газа оказывают воздействие на все компоненты внешней среды, такие как: атмосфера, гидросфера и литосфера, а также растительный и животный мир [1, 2]. Для того чтобы восстановить нарушенный экологический баланс, необходимо провести углубленное исследование, которое позволит изучить воздействие следующих веществ: сероводорода, сернистого ангидрида и иных продуктов, содержащих серу, на человеческий организм.

Природный газ, добываемый на Астраханском месторождении, представляет собой мощный антропогенный токсический и стрессовый фактор, оказывающий влияние на биологические системы жизнеобеспечения, на обменные процессы между микроциркуляторным руслом и клетками тканей [3-5]. Железо, находящееся в молекулах цитохромоксидаз, реагирует с сероводородом, присутствующим в природном газе, образуя прочное соединение, приводящее к развитию в тканях острой гипоксии [6-8]. Кроме того, в результате интоксикации в органах и тканях изменяется равновесие между кислотами и щелочью [9], что приводит к избыточному накоплению свободных радикалов и развитию оксидативного стресса [10].

Цель исследования: изучить функциональную активность ткани селезенки крыс-самцов в нормальных условиях, при хроническом воздействии природного газа Астраханского месторождения, а также при действии тималина и α-токоферола в условиях развивающегося токсического стресса в органе.

Материал и методы исследования. Объектом изучения были 90 самцов белых крыс, которые в условиях вивария имели свободный доступ как к пище, так и к воде.

Изучаемые животные были поделены на несколько групп: контрольные и экспериментальные, в то же время согласно возрасту выделены подгруппы: первая – молодые (неполовозрелые) особи, вторая – половозрелые, третья – старые крысы. Все экспериментальные исследования проводились на животных в осенний и зимний период, чтобы максимально исключить действие сезонных ритмов.

Группы всех экспериментальных крыс в течение 6 недель были подвергнуты хроническому воздействию природного газа Астраханского месторождения с концентрацией по сероводороду при 90±4 мг/м³. Опыты длились 4 часа в день с понедельника до пятницы. Интактных крыс помещали в те же камеры на тот же срок эксперимента, используя состав дыхательной смеси, не содержащей примесей природного газа.

Возрастные группы экспериментальных животных в течение 6-недельного эксперимента через день внутримышечно получали инъекцию 0,01 мг тималина, рассчитанную на 100 г массы тела крысы. Витамин Е в виде 10%-ного масляного раствора α-токоферола ацетата вводили per os с помощью инсулинового шприца без иглы, используя дозу 0,5 мг на 100 г массы тела для каждого стрессированного животного в течение 2 недель до начала постановки эксперимента и на протяжении всего периода воздействия природным газом.

По окончании опытов животным производили инъекцию этаминала натрия внутрибрюшинно, используя дозу 5 мг на 100 г массы тела, затем их декапитировали и осуществляли выделение образцов ткани селезенки. Забор материала проводили с временными интервалами через каждые 20 минут в течение 3 часов начиная от времени прекращения эксперимента. Ткань селезенки гомогенизировали непосредственно перед измерением в гомогенизаторе Даунса, используя фосфатный буфер pH 7,45 при 0,07М.

Биуретовым методом определяли содержание белка в гомогенатах ткани селезенки, используя спектрофотометр Baekman (США) при настройке длины волны на уровне 500–560 нм. Для того чтобы определить уровень содержания альбумина в гомогенатах ткани, мы применяли унифицированный метод, который основан на реакции взаимо­действия альбумина и бромкрезолового зеле­ного. Количественные измерения проводили, используя спектрофотометр Baekman (США) при длине волны на уровне 630–690 нм.

Согласно методике И.Д. Стальной и Т.Т. Гаришвили, модифицированной Е.А. Строевым и В.Г. Макаровой, нами были зарегистрированы показатели свободнорадикальных процессов. По уровню содержания малонового диальдегида (МДА) в нмоль/0,05 г сырого веса ткани изучалось исходное перекисное окисление липидов (ПОЛ), затем определялась скорость спонтанного (Сп. ПОЛ) и аскорбатзависимого (Аск. ПОЛ) (которая измерялась в нмоль) образованного малонового диальдегида (МДА) в пробе в течение 1 часа инкубации. Используя методику Е.Е. Дубининой, С.О. Бурмистрова с соавторами, мы определяли окислительную модификацию белков (ОМБ), основанную на качественной реакции взаимодействия окисленных аминокислотных остатков белков с 2,4-динитрофенилгидразином, в результате которой образуются окрашенные производные динитрофенилгидразона, зарегистрированные нами на спектрофотометре при уровне длины волны в 270 нм.

Статистическая математическая обработка данных ритмогенеза в ткани селезенки изучаемых групп животных проводилась с использованием компьютерных программ «Cosinor Ellipse 2006» и «Microsoft Excel 2007». Нами был зафиксирован основной показатель ритмического процесса – период колебаний, а также изучены амплитуда, акрофаза и мезор. Для определения достоверности различий двух средних и относительных величин использовали t-критерий Стьюдента.

Результаты исследования и их обсуждение. Полученные в ходе исследования колебания уровней содержания альбумина, а также общего белка можно охарактеризовать как ультрадианные с периодами от 20–40 до 60 минут. Уровень амплитуды колебания общего белка и альбумина у неполовозрелых контрольных животных соответствует 47% и 34% от среднего значения (мезора). Угнетение синтетической активности в условиях интоксикации наблюдалось значительное у молодых крыс. В результате зарегистрировано снижение уровней содержания общего белка на 53%, а альбумина на 74% от мезора. Кроме того, зафиксировано снижение амплитуды колебаний общего белка на 9%, но наблюдалось увеличение амплитуды колебаний альбумина на 18%. Очевидно, что такие изменения в колебаниях этого белка связаны с его основной функцией – транспортного белка.

У интактных половозрелых крыс среднее содержание общего белка в ткани селезенки в 2 раза выше, чем у молодых, и в 1,3 раза выше, чем у старых животных. Уровень содержания альбумина у половозрелых крыс в контроле больше на 59%, чем у молодых, и на 10% выше, чем у старых животных. Но при этом амплитуда колебаний содержания белков в ткани селезенки у половозрелых крыс ниже, чем у молодых и старых животных, что, вероятно, связано с более высокой степенью синхронизации спленоцитов у этой группы крыс.

В ткани селезенки стрессированных половозрелых животных динамика уровней содержания общего белка и альбумина продолжает сохранять околочасовую периодичность, хотя в условиях гипоксии, вызванной воздействием природного газа, происходит угнетение синтеза изучаемых белков. Так, при сравнении с контролем у половозрелых крыс зарегистрировано резкое падение уровней общего белка на 11,6% и альбумина на 21,4% от мезора. Токсическое воздействие природного газа на ткань селезенки половозрелых животных вызывает уменьшение амплитуды колебаний общего белка на 20% и альбумина на 19,6%, что модифицирует кинетическую кривую.

В условиях интоксикации в ткани селезенки старых крыс наблюдается снижение амплитуды колебаний как общего белка, так и альбумина на 3% и 1,5% соответственно. В результате эксперимента также зарегистрировано снижение уровня общего белка на 4% и альбумина на 32% от среднего значения (мезора) в сравнении с контролем.

У молодых крыс при гипоксии, вызванной воздействием природного газа, на фоне введения антиоксидантов происходит модификация околочасовых осцилляций в ткани органа. Ответная реакция спленоцитов в условиях стресса характеризуется увеличением среднего содержания общего белка в 4 раза и альбумина в 6,5 раза от среднего значения.

Комплекс антиоксидантов, применяемый в эксперименте, способствовал увеличению амплитуды колебаний альбумина на 2%, но отмечалось снижение амплитуды общего белка на 7% в сравнении с подгруппой ССГ. Очевидно, этот факт свидетельствует о низкой степени синхронизации спленоцитов в ткани селезенки неполовозрелых животных, которая требуется для обеспечения их оптимального функционирования при токсическом стрессе.

У стрессированных половозрелых крыс в условиях гипоксии на фоне введения антиоксидантов ответная реакция ткани характеризуется увеличением общего белка на 10,5% и альбумина на 36%. Комплекс антиоксидантов (тималин и витамин Е), применяемый в эксперименте, способствовал повышению адаптации организма экспериментальных крыс, что в свою очередь проявилось увеличением амплитуды колебаний, и способствовал активизации ферментных систем, необходимых для синтеза общего белка и альбумина.

Введение антиоксидантов группе старых крыс при токсическом стрессе стабилизирует компенсаторные возможности ткани селезенки. Это характеризуется увеличением среднего уровня содержания как общего белка (на 30%), так и альбумина (на 63%) в сравнении с подгруппой стрессированных крыс. При сравнительном анализе на кинетической кривой наблюдалось увеличение амплитуды колебаний общего белка на 4,5%, а альбумина – на 4%.

При сравнении возрастных особенностей параметров оксидативного стресса, регистрируемых в ткани селезенки контрольных животных, отмечено, что у старых животных более высокий уровень содержания продуктов, которые реагируют с тиобарбитуровой кислотой, соответствуя уровню 3,99±0,502 нмоль/0,05 г в ткани (р<0,05), но в то же время он намного меньше, чем у молодых крыс, где зафиксировано 3,25±0,399 нмоль/0,05 г ткани (р<0,05). Ускорение аскорбатзависимого ПОЛ нами наблюдалось (р<0,05) у старых животных в сравнении с группой половозрелых: от 20,39±0,597 и до 40,27±0,719 нмоль/ч (табл. 2, 3). Кроме того, отмечается повышение уровня спонтанного ПОЛ у старых животных в сравнении с группой молодых крыс: от 23,62±0,204 и до 24,42±0,815 нмоль/ч (р<0,05) (табл. 1, 3).

Таблица 1

Уровень свободнорадикальных процессов в селезенке молодых крыс, подвергшихся хроническому стрессу на фоне введения комплекса антиоксидантов (М±m)

Примечание: К – интактные крысы, ССГ – крысы стрессированные в результате воздействия природным газом, ССГ + АО крысы стрессированные в результате воздействия природным газом в условиях применения антиоксидантов; ^*р<0,05, ^**р<0,01 и ^***р<0,001, сравнимое с контролем; ^◊р<0,05, ^◊◊ р<0,01 и ^◊◊◊р<0,001 в сравнении с группой, которая получала ССГ, и с группой ССГ + АО; ^♯р<0,05, ^♯♯р<0,01 и ^♯♯♯р<0,001 в сравнении К группы и подгруппы, которая получала ССГ + АО (обозначения здесь и далее те же).

Наиболее высоким уровень ОМБ оказался в ткани селезенки старых крыс – 0,69±0,029 мкмоль/мг белка (р<0,05), хотя у половозрелых контрольных животных уровень на 80% ниже (табл. 2) (р<0,001).

Таблица 2

Уровень свободнорадикальных процессов в селезенке половозрелых крыс, подвергшихся хроническому стрессу на фоне введения комплекса антиоксидантов (М±m)

Данные эксперимента показали, что хроническое воздействие серосодержащего газа Астраханского месторождения изменяет активность свободнорадикальных процессов в ткани селезенки, а также уровень антиоксидантной защиты.

Ответная реакция работы исследуемого органа при воздействии экзотоксиканта зависит от возраста изученных животных. Нами обнаружено, что при токсическом стрессе с возрастом увеличивается количество продуктов, которые реагируют с тиобарбитуровой кислотой, именно это и приводит к формированию окислительного стресса. Об этом также свидетельствует рост всех показателей исходного ПОЛ, аскорбатзависимого ПОЛ и спонтанного ПОЛ у старых крыс в сравнении как с неполовозрелыми, так и с половозрелыми животными (р<0,001) (табл. 1, 2, 3).

Таблица 3

Уровень свободнорадикальных процессов в селезенке старых крыс, подвергшихся хроническому стрессу на фоне введения комплекса антиоксидантов (М±m)

Зафиксированные показатели повышения исходного ПОЛ до уровня 17,18±0,931 нмоль/0,05 г ткани, усиление скорости спонтанного до уровня 118,32±0,295 нмоль/ч и индуцированного ПОЛ до уровня 125,34±0,755 нмоль/ч соответственно усугубляют токсический эффект сероводорода в ткани селезенки старых крыс (табл. 1-3).

Более низкий уровень исходного ПОЛ (р<0,001) в условиях гипоксии, вызванной воздействием природным газом, зарегистрирован у неполовозрелых животных – 8,14±0,660 нмоль/0,05 г ткани.

Анализируя результаты исследования у молодых и половозрелых крыс в условиях стресса, можно отметить рост скорости спонтанного ПОЛ (р<0,05) у половозрелых животных на 13%, но замедление индуцированного ПОЛ (р<0,05) на 15%. В ткани селезенки неполовозрелых крыс при хроническом стрессе в сравнении с интактной группой этого возраста зафиксировано наибольшее возрастание уровня исходного ПОЛ на 150,5% (р<0,001), наблюдалось увеличение в 3,7 раза скорости спонтанного ПОЛ (р<0,001) и в 3 раза – скорости аскорбатзависимого ПОЛ (р<0,001), также отмечено повышение на 35% уровня ОМБ (р<0,01). Полученные результаты свидетельствуют об усилении свободнорадикальных процессов, индуцированных действием токсиканта на ткань селезенки неполовозрелых крыс, и более выраженных компенсаторных возможностях органа половозрелых животных.

Уровень ОМБ (табл. 1, 2, 3) увеличивается во всех возрастных группах стрессированных животных (р<0,001), что свидетельствует не только об эффекте токсического действия сероводородсодержащего газа на ткань селезенки, но и о его способности развивать оксидативный стресс в органе независимо от возраста крыс.

Тималин в сочетании с α-токоферолом на фоне хронической ингаляции газа проявил выраженные антиоксидантные и иммуномодулирующие свойства, вызвав снижение уровня изучаемых показателей свободнорадикальных процессов в селезенке крыс трех возрастных групп. Наибольший корригирующий эффект комплексного введения препаратов был зафиксирован у половозрелых крыс в сравнении с контрольными данными (р<0,001) групп молодых и старых животных.

Скорость аскорбатзависимого ПОЛ снижается (р<0,001) как у молодых, так и у старых крыс, но не достигает контрольных значений (табл. 1, 3). Очевидно, это связано с истощением компенсаторных возможностей спленоцитов в этих возрастных группах. Однако комбинирование препаратов в эксперименте вызвало уменьшение уровня ОМБ в сравнении с контролем на 94% (р<0,001) у неполовозрелых крыс, на 43% (р<0,05) этот же показатель зарегистрирован ниже у половозрелых животных и на 90% (р<0,05) меньше у старых крыс. Это еще раз свидетельствует о наличии корригирующего эффекта применяемых препаратов на белковый обмен ткани селезенки.

Заключение

Гипоксия, вызванная воздействием природным газом, приводит к снижению амплитуды колебаний общего белка и альбумина в ткани селезенки всех возрастных групп, хотя кинетическая кривая продолжает сохранять околочасовую периодичность. Зарегистрированные изменения в эксперименте носят обратимый характер, так как введение тималина и α-токоферола модифицирует кинетическую кривую, повышая во всех возрастных группах амплитуду колебаний, а также уровень среднего содержания общего белка и альбумина. Совместное введение используемых в эксперименте лекарственных средств – тималина и α-токоферола – у всех возрастных групп на фоне хронического действия природного газа выявило их антиоксидантные свойства, которые способствовали  снижению уровня свободнорадикальных процессов.