Традиционно целесообразность посмертного микробиологического исследования в практике патоморфологов определяется возможностью подтверждения диагноза и установления этиологии не диагностированной при жизни инфекции, при которой смерть наступает еще до проведения соответствующей микробиологической диагностики, оценкой эффективности прижизненной антибактериальной терапии, выяснением эпидемиологической ситуации и своевременным проведением соответствующих противоэпидемических мероприятий [1, 2]. Однако специфика задач, решаемых судебно-медицинскими экспертами, подразумевает научно обоснованное понимание процессов разложения. Значимой компонентой в процессе разложения является его микробиологическая составляющая.
Целью работы является описание способа изучения основных микробиологических тенденций разложения трупа. Данные сведения необходимы как для обоснования и широкого применения микробиологических методов в судебно-медицинской практике [3], так и для формирования объективной научной базы в целях установления причинно-следственных закономерностей микробной трансформации органического вещества в природе.
Традиционные методы исследований. R. Melvin с соавт. [4] одними из первых отметили, что определение давности наступления смерти для судебного эксперта с использованием существующих методов является сложной, а иногда и объективно неразрешимой задачей. Они предложили животную модель для оценки продолжительности посмертного периода путем оценки трансмиграции нормальной микробиоты через стенку тонкой кишки.
Результаты исследований посмертных изменений микрофлоры с использованием модельных экспериментов на трупах животных являются серьезной доказательной базой. J.L. Metcalf с соавторами [5] использовали трупы мышей, у которых в течение 48 суток отбирали микрофлору из брюшной полости и с поверхности кожных покровов. Кроме того, осуществлялся забор образцов из связанного с трупами могильного грунта (ложа трупа) для оценки микробного разнообразия и степени рН.
- L. Pechal с соавт. [6] использовали для экспериментов трупы свиней (в качестве модели трупа человека), разложенные на поверхности почвы в лесу и укрытые сетками с целью защиты от птиц. Регулярно регистрировались изменения температуры трупов и почвы. Отбор проб производился из ротовой полости и с поверхности кожи трупов. Определение разнообразия организмов, связанных с разложением тел, производилось методом пиросеквенирования.
- E. R. Hyde с соавт. [7] проводили исследования на трупах людей. Для этого эксперимента два трупа были размещены для разложения в естественных условиях. Наблюдения производились в течение нескольких дней в сентябре и в ноябре 2011 г. Зафиксированы среднесуточные условия температуры и влажности за исследуемый период. Образцы материала изымались изо рта и прямой кишки трупов в начале и в конце каждого временного отрезка исследования. Использовался метод пиросеквенирования.
H.R. Johnson [8] также использовали образцы, взятые из 21 трупа людей. Все трупы были размещены на поверхности почвы и разлагались естественным путем. Образцы забирали из слухового прохода и/или носовых ходов, состав микробного сообщества устанавливался на основе генотипирования.
Оригинальные методы исследований. Практически любое микробное сообщество представлено эукариотическими и прокариотическими организмами. В данном исследовании изучены представители мира Procaryota, а именно эубактерии, что связано с их доминирующим положением в сообществе, контролирующем разложение мертвого органического вещества.
В качестве показателей интенсивности разложения трупа использованы качественные и количественные характеристики его микрофлоры или некробиома. Труп является доступным источником органических форм азота и углерода для гетеротрофных бактерий, которые используют белки и углеводы в процессах катаболизма и могут оказывать большое влияние на направленность трупного разложения.
Некробиомы трупа и его ложа в разных экосистемах вариабельны, взаимодействия на уровне сообщества довольно специфичны, отдельные микроорганизмы находятся в облигатном симбиозе с другими, зависят от качественного и количественного состава их метаболитов, что чрезвычайно затрудняет использование видов для оценки продолжительности посмертного интервала. Поэтому изменчивость микробиомов целесообразно исследовать вдоль катены, обусловленной климатом, местностью, последовательной сменой насекомых или растительности.
С целью изучения особенностей микробного разложения трупа проанализированы: таксономическое разнообразие микроорганизмов, населяющих труп и ложе трупа экспериментальных животных; эколого-физиологическое разнообразие микроорганизмов в составе микрофлоры трупа; динамика численности и структура доминантных видов микроорганизмов в разные периоды разложения трупа; ферментативная активность доминантных групп микроорганизмов в составе микрофлоры трупа; особенности физиологических групп микроорганизмов – участников диагенеза костных фрагментов. Кроме того, создан каталог аммонификаторов с характеристикой подходов к систематизации и методам хранения коллекционных культур.
Несмотря на то что в природе постоянно происходит гибель организмов, обнаружить их непосредственно сразу после наступления смерти и провести полноценное исследование не представляется возможным. Поэтому для исследований используют заранее умерщвленных животных. Необходимо отметить, что труп может находиться в любых условиях (в помещении, на поверхности почвы, захороненным в почве). В зависимости от этого, а также от возможности доступа к трупу некрофильных насекомых, позвоночных животных процесс деструкции трупа протекает различно. В данной работе в качестве объекта исследования использована гетеротрофная группа бактерий в составе микробного сообщества трупа, находящегося на поверхности почвы, и ложа трупа (непосредственно самой почвы). Предметом исследования являлись трупы некоторых представителей семейства Млекопитающие, массой от 80 г до 100 кг.
Использованы традиционные методы выделения чистой культуры микроорганизмов с последующим изучением их фенотипических признаков согласно алгоритму «Определителя бактерий Берги» [9]. Учитывая особенности фенотипического полиморфизма прокариот, не позволяющего объективно оценивать таксономические признаки, в работе также применены современные молекулярно-генетические подходы к идентификации видов бактерий, что облегчает определение некультивируемых форм и видов, не поддающихся точной идентификации.
Разработана оригинальная схема закладки трупных приманок, забора микробиологических образцов, выделения и идентификации видов бактерий, отнесенных к пяти эколого-физиологическим группам в составе некробиома. Исследования выполнялись на свежевыделенных культурах, репрезентативность выборок соответствовала общестатистическим закономерностям.
Методика закладки трупов крупных и средних животных подробно изложена в работах О.С. Лавруковой с соавт. [10, 11]. Опыты по разложению 45 трупов мышей закладывались весной 2016 г. на песчаных и торфяных почвах, на суглинке.
Микрофлору ложа и фрагментов органов и тканей трупа отбирали из областей, в наибольшей степени подвергающихся микробной контаминации, помещали в асептических условиях в пробирки со стерильной транспортной средой (5 мл) для дальнейшего исследования. Посмертную микрофлору с костных останков и копыт трупов свиней отбирали методом смывов. Параллельно измеряли температуру и кислотность трупа и окружающей среды.
Для выделения и идентификации фирмикутных и грациликутных бактерий в составе некробиома использовали наборы «Микро-Циль-Нильсен-Ницф», «Микро-Гинс-Ницф», «Микро-Цитохромоксидаза-Ницф», «Микро-Каталаза-Ницф», «Микро-Желатиназа-Ницф», короткий ряд Гисса, сульфатредуцирующий агар, среды Блаурокка и Китт–Тароцци. Таксономическую идентификацию, как было указано выше, производили с использованием алгоритма определения вида с помощью «Определителя бактерий Берги» [9].
Изучение сукцессии микроорганизмов базировалось на определении возможностей функционирования сообщества микробов в разных экосистемах и степени их изменения в зависимости от территории расположения и срока разложения трупа, доступности питательного субстрата и температуры окружающей среды. Причинно-следственный анализ последовательной смены микробных сообществ трупов животных и ложа трупа проводился на специально оборудованных площадках в лесной зоне (северное Прионежье Республики Карелия) и в зоне населенного пункта (частный сектор г. Петрозаводска).
При анализе распределения эколого-физиологических профилей микробных сообществ в составе некробиома трупа и ложа трупа учитывались район исследования, территориальное размещение, характер растительности и особенности почвенного покрова. В каждом биоценозе и в каждой функциональной зоне для проведения микробиологического анализа пробы отбирались случайным образом с пяти пространственно удаленных станций, где рандомно выполнялся стратифицированный отбор фрагментов наружных покровов (кожи, шерсти), мягких тканей, костей трупа и ложа трупа. Изменения температуры в почве и трупе регистрировались в трехкратной повторности с помощью прибора «4В1 PН метра», температура воздуха измерялась беспроводным термометром «RST 01077».
Микробиологический анализ выполнялся с использованием принципа накопительных культур. В эксперименте применялись стандартные методы бактериологических исследований на основных, элективных и дифференциально-диагностических средах; учитывались только физиологически активные группы микроорганизмов, дающие выраженный культуральный рост на указанных средах.
Как указано выше, для описания микробных сообществ трупа и ложа трупа использованы пять эколого-физиологических групп: протеолитики, целлюлозолитики, азотфиксаторы, прототрофы, сульфатредукторы. Для их описания применялись ультраструктурные, морфологические, культуральные и биохимические признаки.
Учитывая, что при разложении трупа ведущая роль принадлежит микроорганизмам, контролирующим гнилостный распад белковых веществ или аммонификацию, основное внимание в исследовании микрофлоры трупа уделено изучению протеолитически активных групп бактерий, выделенных в чистую культуру. Методы идентификации чистых культур в составе ассоциации некробиома описаны в работах О.С. Лавруковой с соавт. [12] и Н.А. Сидорова с соавт. [13]. Казеинолитическую (или общую протеолитическую) активность оценивали по методу Ансона в модификации И.С. Петровой (1966). При интерпретации полученных данных учитывали основные абиотические факторы, зафиксированные на момент отбора проб.
С целью изучения разнообразия физиологических групп микроорганизмов, контролирующих трансформацию костных останков в природе, труп экспериментального животного сначала помещали в природные условия на специально оборудованную площадку для развития гнилостных явлений. Затем кости изымали из естественной среды и в лабораторных условиях помещали в нестерильную, увлажненную огородную почву для создания эффекта «почвенной ловушки» для микроорганизмов, участвующих в разложении костной ткани. Модельные опыты проведены при разных температурных условиях: +37°С, +21°С и +5°С. Общая продолжительность эксперимента составила 14 месяцев.
Микрофлору с фрагментов костей отбирали методом смывов с помощью стерильных тампонов. Для получения статистически достоверных результатов смывы с пробной поверхности отбирали рандомно от трех до пяти образцов. Микробиологический анализ проводили сразу после отбора образцов. Для этого пробы суспензировали в физиологическом растворе и в объеме 0,1 мл инокулировали в элективные питательные среды, предназначенные для развития узкой группы микроорганизмов, выполняющих определенную функцию в процессе диагенеза.
Для преимущественного выделения из смывов с поверхности костей спорообразующих аммонифицирующих бактерий предварительно проводили пастеризацию отобранных смывов, при этом вегетативные клетки погибали, сохранялись только спорогенные бактерии. С учетом принадлежности выделяемых микробов к мезофилам накопительные культуры получали при комнатной температуре в диапазоне от 24±3°С до 37±1°С. Учет количества представителей определенной физиологической группы проводили методом предельных разведений с использованием таблицы Мак-Креди.
На базе ФИЦ «Фундаментальные основы биотехнологии» лаборатории молекулярной диагностики ЦКП «Биоинженерия» (Москва) выполнено генотипирование шести культур микроорганизмов с неясным таксономическим положением. Для этого выделены препараты ДНК, получены ПЦР-фрагменты генов, кодирующих 16S рРНК, проведено секвенирование этих фрагментов, осуществлена оценка степени чистоты культур. Проведен BLAST-поиск по международной базе данных GenBank, с помощью онлайн-сервиса RDP-Classifier определена таксономическая принадлежность исследованных бактерий.
Для изучения направленности процессов биогенной деструкции костного коллагена проведена серия модельных экспериментов по выделению в чистую культуру коллагеназ-продуцирующих микроорганизмов рода Bacillus и рода Clostridium. Культивирование продуцентов коллагеназ выполняли с увеличением диапазона температур от +20оС до +50°С в суховоздушном охлаждающем термостате ТСО-1/80 СПУ. Идентификацию выделенных бактерий до вида выполняли согласно критериям «Определителя бактерий Берги» [9]. Для анализа коллагеназной активности бацилл и клостридий использовали модифицированный метод агаровых блоков Н.С. Егорова [14]. Питательную среду для визуализации ферментативной активности микроорганизмов готовили по Q. Wu с соавт. [15] в авторской модификации.
Заключение. Использование предложенного алгоритма изучения процессов разложения трупа, опосредованного деятельностью микроорганизмов, позволяет подробно проанализировать основные закономерности разложения трупов различных по размеру и массе экспериментальных животных на протяжении длительных отрезков времени, изучить микробиом трупов и эпинекротическое микробное сообщество, применить традиционные (бактериологические и бактериоскопические) и современные (молекулярно-генетические) методы исследования. Результаты подобных исследований могут быть использованы в судебно-медицинской экспертизе для решения остро стоящих экспертных проблем, в частности для определения давности наступления смерти в поздний постмортальный период и выявления микробиологического патоморфоза посттравматических изменений.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Статья подготовлена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации в рамках выполнения государственного задания. Реализовано в рамках Программы развития опорного университета ФГБОУ ВО «Петрозаводский государственный университет» на период 2017–2021 гг. Секвенирование фрагментов генов 16S рРНК исследованных микроорганизмов выполнено с использованием научного оборудования ЦКП «Биоинженерия» ФИЦ Биотехнологии РАН.