Рак поджелудочной железы (РПЖ) является четвертой ведущей причиной смерти от рака как у мужчин, так и у женщин, более 200 тысяч человек в мире умирает ежегодно по этой причине [1; 2]. В России число заболевших РПЖ в 2018 г. достигло 19 165 человек, что составило 3,1% в структуре онкологической заболеваемости. При этом наблюдается ежегодный прирост новых случаев РПЖ, и в 2018 году он был выше показателей 2008 г. на 32,7% у мужчин и на 39,3% у женщин. Прирост смертности от РПЖ за период 2008-2018 гг. составил 20%, что уступает только опухолям ЦНС [3].
Наиболее распространена протоковая аденокарцинома, наблюдающаяся в 80% случаев рака поджелудочной железы. Панкреатическая аденокарцинома обычно протекает бессимптомно, и заболевание проявляется только после того, как опухоль вторгается в окружающие ткани или метастазирует в отдаленные органы [4]. Особый интерес вызывают нейроэндокринные опухоли поджелудочной железы, развивающиеся из нейроэндокринных клеток, поскольку подавляющее большинство нейроэндокринных опухолей локализуется именно в поджелудочной железе [5]. Панкреатические нейроэндокринные новообразования разделяют на высокодифференцированные, называемые «панкреатическими нейроэндокринными опухолями», и низкодифференцированные – «панкреатический нейроэндокринный рак» [6]. Эта разновидность раковых опухолей до сих пор плохо изучена. При этом нейроэндокринные опухоли поджелудочной железы являются наиболее распространенными причинами смерти у пациентов с синдромом множественной эндокринной неоплазии [7; 8]. Особенно плохо изученными являются смешанные карциномы поджелудочной железы – ненейроэндокринные опухоли с нейроэндокринным компонентом. В этой связи актуальным является наиболее раннее выявление наличия нейроэндокринного компонента у больных со злокачественным поражением поджелудочной железы и изучение молекулярных особенностей при разном гистотипе опухолей.
Процессы свободнорадикального окисления и генерации активированных метаболитов играют важную роль в инициации злокачественной трансформации и прогрессировании неоплазии. Доказано участие этих процессов в регуляции основополагающих клеточных программ, таких как пролиферация, дифференцировка, апоптоз [9-11]. И в настоящее время первостепенное значение оксидативного стресса при опухолевом росте не вызывает сомнения [12].
Целью работы явился сравнительный анализ интенсивности перекисного окисления липидов и функционирования ферментативного звена антиоксидантной системы в крови больных со злокачественным поражением поджелудочной железы в зависимости от наличия в опухоли нейроэндокринного компонента.
Материалы и методы исследования
До начала лечения в крови больных с предварительным диагнозом рака поджелудочной железы (РПЖ) были исследованы показатели свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы. После гистологического исследования образцов опухоли, полученных в процессе оперативного лечения больных, которое включало оценку экспрессии двух нейроэндокринных маркеров хромогранина А и синаптофизина, было установлено, что у 9 больных (6 мужчин и 3 женщины) был хронический панкреатит, у 12 больных (6 мужчин и 6 женщин) – нейроэндокринный РПЖ, у 9 – аденокарцинома ПЖ (6 мужчин и 3 женщины) и у 21 (9 мужчин и 12 женщин) – аденокарцинома с нейроэндокринным компонентом, составляющим от 1% до 10-30%. В данной работе представлено исследование показателей оксидативного статуса крови у 42 больных (21 мужчина и 21 женщина, в возрасте от 50 до 79 лет) со злокачественным поражением ПЖ в сравнении с группой доноров, в состав которой вошли 22 человека без злокачественных заболеваний (11 условно здоровых мужчин и 11 женщин, средний возраст 58,1±2,4). Интенсивность процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в крови оценивали по содержанию молекулярных продуктов: наиболее стабильного соединения – вторичного продукта ПОЛ малонового диальдегида (МДА) и первичных продуктов ПОЛ диеновых конъюгатов. О состоянии антиоксидантной системы крови судили по активности и содержанию ферментов первой линии антиоксидантной защиты – супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы. Активность СОД, каталазы, содержание МДА и диеновых конъюгатов определяли общепринятыми спектрометрическими методами [13]. В плазме крови ИФА-методами изучено содержание изоформ супероксиддисмутазы (СОД1 и СОД3) и содержание каталазы.
Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета программ Statistiсa 6.0 по t-критерию Стьюдента для двух независимых выборок, предварительно проверив данные в группах на соответствие нормальному распределению по критерию Колмогорова-Смирнова и по W-критерию Шапиро-Уилка для малых выборок. В таблицах данные представлены в виде М ± m, где М - выборочное среднее, m – ошибка среднего. Определяли также медиану (Me), которая во всех исследованных группах практически не отличалась от M. Различия считали статистически значимыми при p<0,05, а при 0,1>p>0,05 – на уровне статистической тенденции к значимости.
Результаты исследования и их обсуждение
Во всех группах больных с поражением поджелудочной железы исследовали содержание МДА и диеновых конъюгатов как в плазме крови, так и в гемолизате эритроцитов (табл. 1).
Таблица 1
Содержание продуктов перекисного окисления липидов в плазме и эритроцитах крови больных с поражением поджелудочной железы разного гистотипа
|
Группы |
МДА пл. нМ/мл плазмы |
МДА эрит. нМ/мл 1% гемолизата |
Диеновые конъюгаты пл. ед./мл плазмы |
Диеновые конъюгаты эрит. ед./мл 20% гемолизата |
|
Доноры, n=22 |
5,767±0,269 |
2,718±0,161 |
0,89±0,159 |
0,378±0,082 |
|
Нейроэндокрин. РПЖ, n=12 |
7,337±0,534 р=0,006004 |
2,66±0,285 р>0,1 |
2,357±0,178 р=0,000002 |
1,112±0,18 р=0,000341 |
|
Аденокарцинома ПЖ, n=9 |
5,71±0,313 р>0,1 |
2,325±0,274 р>0,1 |
2,191±0,258 р=0,000140 |
1,09±0,204 р=0,000764 |
|
Аденокарцинома с нейроэндокринным компонентом, n=21 |
7,979±0,551 р=0,000610 |
2,756±0,152 р>0,1 |
1,949±0,168 р=0,000050 |
0,617±0,095 р=0,071182 |
Примечание: р – статистическая значимость различий относительно группы доноров.
Содержание МДА в плазме крови было увеличено при нейроэндокринном РПЖ на 27,2% и при аденокарциноме с нейроэндокринным компонентом – на 38,4% относительно группы доноров (р<0,01). В отличие от плазмы крови значимых изменений МДА в эритроцитах при патологии поджелудочной железы выявлено не было.
Содержание диеновых конъюгатов было повышено во всех исследованных нами группах больных как в плазме крови, так и в эритроцитах. При нейроэндокринном РПЖ увеличение в плазме и эритроцитах достигало 2,6 и 2,9 раза соответственно, при аденокарциноме – 2,5 и 2,9 раза, при аденокарциноме с нейроэндокринным компонентом составляло 2,2 раза в плазме крови, а в эритроцитах просматривалась лишь тенденция к увеличению.
Интересно, что у больных аденокарциномой с нейроэндокринным компонентом степень увеличения продуктов ПОЛ зависела от процентного содержания последнего. Содержание диеновых конъюгатов в плазме больных с 1% нейроэндокринного компонента было увеличено относительно группы доноров в 1,6 раза (р=0,015), у больных с 10% нейроэндокринного компонента – в 2,65 раза (р=0,00019), у больных с 30% нейроэндокринного компонента – в 3,5 раза (р=0,00003), а в эритроцитах значимое увеличение диеновых конъюгатов в 2,2 раза (р=0,0054) выявлено только у больных с 10% нейроэндокринного компонента. Увеличение содержания МДА, напротив, было максимальным (на 61,6%, р=0,000002) у больных с 1% нейроэндокринного компонента.
СОД является ключевым антиоксидантным ферментом, осуществляющим реакцию дисмутации супероксид-анион радикала (О2-). К основным изоформам СОД у млекопитающих относятся внутриклеточная медь-цинковая (Cu,Zn-СОД; СОД1), находящаяся в цитоплазме и внутриклеточных структурах, и экстрацеллюлярная (Э-СОД; СОД3). Вторым ферментом первой линии антиоксидантной защиты, функционально сопряженным с СОД, является каталаза, осуществляющая разложение H2O2, образуемой при дисмутации супероксид-анион радикала. В организме человека максимальное содержание каталазы обнаружено в эритроцитах. Нами изучены активность Cu,Zn-СОД, каталазы и соотношение активностей этих ферментов в эритроцитах (табл. 2).
Таблица 2
Активность антиоксидантных ферментов в эритроцитах крови больных с поражением поджелудочной железы разного гистотипа
|
Группы |
СОД ед. актив./мл
|
Каталаза мкМ Н2О2/мин. ×мг Hb |
Коэффициент СОД/каталаза |
|
Доноры, n=22 |
446,6±13,8
|
129,9±5,26 |
3,513±0,111
|
|
Нейроэндокрин. РПЖ, n=12 |
269,12±13,5 р=0,000000 |
69,51±5,42 р=0,000000 р1=0,008543 |
4,065±0,308 р=0,046005 |
|
Аденокарцинома ПЖ, n=9 |
289,3±14,9 р=0,000000 |
73,49±7,58 р=0,000002 |
4,183±0,338 р=0,019448 |
|
Аденокарцинома с нейроэндокринным компонентом, n=21 |
334,6±15,1 р=0,000002 |
89,64±4,66 р=0,000001 |
3,895±0,226 р>0,1 |
Примечание: р – статистическая значимость различий относительно группы доноров; р1 – статистическая значимость различий относительно группы больных аденокарциномой с нейроэндокринным компонентом.
Как активность СОД, так и активность каталазы были статистически высоко значимо снижены во всех группах больных: при нейроэндокринном РПЖ на 39,7% и 46,5% соответственно, при аденокарциноме поджелудочной железы на 35,2% и 43,4%, при аденокарциноме с нейроэндокринным компонентом на 25,1% и 31% (р≤0,000002) по сравнению с группой доноров. Наиболее низкая активность была характерна для каталазы при нейроэндокринном РПЖ, а также для больных аденокарциномой с 10% нейроэндокринного компонента – на 44,7% ниже, чем у доноров (р=0,000019).
Несмотря на однонаправленные изменения активности двух основных антиоксидантных ферментов, коэффициент их соотношения, отражающий скоординированность сопряженной работы ферментов первой линии антиоксидантной защиты – СОД и каталазы в эритроцитах, был повышен у большинства больных: при нейроэндокринном РПЖ в среднем на 15,7%, при аденокарциноме поджелудочной железы на 19,1% (р<0,05). Наибольшее увеличение соотношения СОД и каталазы наблюдалось у больных с наличием 10% нейроэндокринного компонента при аденокарциноме: К СОД/каталаза превышал уровень в группе доноров на 56,8% (р=0,000000) и был выше, чем в других группах, на 31,7-35,5% (р=0,01-0,02).
В организме человека максимальное содержание каталазы обнаружено в эритроцитах. Во внеклеточных жидкостях она быстро теряет свою активность в результате действия протеолитических ферментов и, как считают, не играет существенной защитной роли, однако при некоторых заболеваниях, сопровождаемых острыми воспалительными процессами, повышение содержания каталазы в сыворотке крови может препятствовать окислению функционально важных молекул и структур [14].
В этой связи мы исследовали не только активность каталазы в эритроцитах, но и ее активность и содержание в плазме крови, а также содержание СОД1 и СОД3 в плазме крови (табл. 3).
Таблица 3
Активность каталазы и содержание ферментов антиоксидантной защиты в плазме крови больных с поражением поджелудочной железы разного гистотипа
|
Группы |
Активность каталазы нм Н2О2/мин. |
Содержание каталазы нг/мл |
Содержание СОД 1 нг/мл |
Содержание СОД 3 нг/мл |
|
Доноры, n=22 |
29,64±1,66 |
0,295±0,025 |
8,165±0,617 |
8,058±0,601
|
|
Нейроэндокрин. РПЖ, n=12 |
23,83±2,26 р=0,047053 р1=0,002885 |
0,393±0,031 р=0,021998 |
11,949±0,504 р=0,000248 |
7,306±1,264 р>0,1 |
|
Аденокарцинома ПЖ, n=9 |
35,9±2,75 р=0,056207 |
0,537±0,097 (n=9) р=0,002216 0,349±0,033 (n=6) 0,913±0,033 (n=3) р=0,000000 |
9,786±1,224 р>0,1
|
7,162±1,079 р>0,1 |
|
Аденокарцинома с нейроэндокринным компонентом, n=21 |
27,78±2,41 р>0,1 |
0,375±0,022 р=0,021203 |
12,923±0,564 р=0,000002 |
7,653±0,617 р>0,1
|
Примечание: р – статистическая значимость различий относительно группы доноров; р1 – статистическая значимость различий относительно группы больных аденокарциномой.
Различия активности каталазы в плазме крови больных относительно группы доноров были в основном на уровне тенденции к статистической значимости. Однако при сравнении между собой групп больных с разной гистологической картиной поражения поджелудочной железы были выявлены существенные различия. Наиболее низкая активность каталазы в плазме наблюдалась у больных нейроэндокринным раком, наиболее высокая – при аденокарциноме, и особенно при аденокарциноме с 10% нейроэндокринного компонента, где она была выше, чем при нейроэндокринном раке, на 50,7-57,1%. Анализируя уровень продуктов ПОЛ в этих группах, можно предположить, что высокая активность каталазы в плазме способствует низкому содержанию МДА, которое у таких больных оставалось на уровне, близком к значению у доноров. В то же время отсутствовала какая-либо зависимость между содержанием диеновых конъюгатов и активностью каталазы в плазме.
Содержание молекул каталазы было повышено во всех группах больных со злокачественным поражением поджелудочной железы: при нейроэндокринном РПЖ на 33,2%, при аденокарциноме с нейроэндокринным компонентом на 27,1%, при аденокарциноме поджелудочной железы на 82% относительно группы доноров. При этом у трети больных аденокарциномой наблюдалось более чем трехкратное превышение уровня доноров.
Содержание СОД1 было повышено у больных нейроэндокринными опухолями и аденокарциномой с нейроэндокринным компонентом на 46,3% и 58,3% соответственно, в то время как значимого изменения содержания СОД3 не наблюдалось ни в одной из групп.
Нами также были подсчитаны коэффициент отношения активности СОД эритроцитов к содержанию цитозольной формы фермента (Cu/Zn SOD; СОД1) и коэффициент отношения активности и содержания каталазы в плазме крови. Как оказалось, данные показатели для обоих ферментов были снижены во всех группах больных со злокачественным поражением поджелудочной железы. Снижение коэффициента для СОД составляло от 44,1% до 62,8% (р=0,005-0,000001) и было наиболее выраженным при нейроэндокринном раке. Снижение коэффициента каталазы также было максимальным для нейроэндокринного рака – 45,2% (р=0,00017), при аденокарциноме составляло 28,3% (р=0,034), а при аденокарциноме с нейроэндокринным компонентом в среднем достигало 31,4% (р=0,0027).
Снижение не только активности, но и соотношения активности к содержанию ферментов первой линии антиоксидантной защиты в плазме крови, а также нарушение сбалансированной работы СОД и каталазы (на что указывает изменение коэффициента активностей этих ферментов в эритроцитах) свидетельствует о существенном нарушении ферментативного звена антиоксидантной защиты как при аденокарциноме, так и особенно при нейроэндокринном раке поджелудочной железы.
Во всех группах больных со злокачественным поражением поджелудочной железы нами выявлен повышенный уровень в плазме крови молекул СОД1 и каталазы, что может быть связано с выходом этих ферментов из мест локализации в результате увеличения проницаемости клеточных мембран. При аденокарциноме наблюдалось выраженное повышение как активности, так и содержания каталазы в плазме крови, что, по-видимому, обеспечивало более низкое содержание МДА. Полученные нами данные позволяют думать о наличии антиоксидантных свойств не только у эритроцитарной каталазы, но и у фермента, выходящего в кровь, в то время как ранее считалось, что данный фермент, не имеющий собственной внеклеточной формы, не играет существенной роли в антиоксидантной защите [15].
Заключение
Анализ полученных данных позволяет прийти к заключению о том, что при злокачественном поражении поджелудочной железы более выраженная интенсификация ПОЛ характерна для нейроэндокринного рака, чему способствует более значительное снижение активности ферментов первой линии антиоксидантной защиты в эритроцитах и сниженная активность каталазы в плазме крови по сравнению с показателями при аденокарциноме.