В настоящее время лимфопролиферативные заболевания (ЛПЗ) остаются наиболее актуальными в клинической онкогематологии. В последние годы характерной особенностью эпидемиологии хронического лимфолейкоза (ХЛЛ) в западных странах и в России является неуклонный рост заболеваемости [1]. Гетерогенность лимфом по биологическим свойствам, морфологическому строению, клиническим проявлениям, ответу на терапию и прогнозу обоснованно привлекает внимание [2]. В странах Европы и Северной Америки это наиболее распространенный вид лейкоза. Ежегодная заболеваемость им составляет 4:100 000 в год и непосредственно связана с возрастом. У лиц старше 80 лет она составляет >30:100 000 в год [3].
Несмотря на длительную историю изучения, этиология ХЛЛ до конца неизвестна. В литературе в основном высказываются мнения о факторах, способствующих увеличению риска развития лимфоидных опухолей [4].
В 80–90% случаев развитие опухолевого процесса связано с воздействием химических агентов [4]. Поэтому в последнее время актуальными стали исследования по изучению возможного вклада в процесс онкогенеза индивидуальной специфики функционирования системы биотрансформации ксенобиотиков, обусловленной наличием полиморфизма соответствующих генов [4, 5]. Полиморфизмы в генах, кодирующих ферменты метаболизма ксенобиотиков, рассматриваются как факторы риска, модифицирующие предрасположенность к раку.
Расшифровка механизмов участия изоформ ферментов биотрансформации в процессах активации и детоксикации широкого круга химических канцерогенов позволила сделать вывод о том, что функционально значимый полиморфизм генов биотрансформации может влиять как на развитие определенного заболевания, характер его клинического течения, так и на эффект от терапии.
Патогенетически обоснованным представляется поиск новых маркеров прогностической стратификации ХЛЛ среди генетических факторов.
Исследование полиморфизма генов цитокинов и системы детоксикации ксенобиотиков уже сейчас позволяет прогнозировать развитие и течение различных форм ХЛЛ [6].
В литературе встречается немало сведений о наличии связи полиморфизма генов биотрансформации ксенобиотиков с возникновением и особенностями клинического течения онкогематологических заболеваний (например, с острыми миелобластными и лимфобластными лейкозами, множественной миеломой, болезнью Ходжкина, хроническим миелолейкозом и неходжкинскими лимфомами) [7].
Кроме того, указанные гены, контролируя синтез ферментов, участвующих в метаболизме фармакологических препаратов, могут влиять на чувствительность к терапии у онкогематологических больных. При этом доказано, что различная способность метаболизировать лекарственные препараты обусловливает индивидуальный риск рецидивов и разный ответ на терапию у пациентов с коморбидными состояниями [7, 8].
Изучение особенностей терапевтической эффективности препаратов в зависимости от полиморфизма генов цитокинов при лечении лимфом даст начало патогенетическому подходу к их лечению. В частности, наличие ассоциации полиморфизма указанных генов с особенностями ответа на химиотерапевтические препараты позволит использовать его в качестве фактора прогноза эффективности лечения.
Несмотря на существенный прогресс в терапии, ХЛЛ остается неизлечимым заболеванием. Целью лечения в настоящее время является увеличение доли общей выживаемости и выживаемости без прогрессирования при минимальном уровне токсичности. Это особенно важно у пожилых людей, имеющих сопутствующие заболевания [9].
С конца 1990-х гг. в клинической практике активно используется моноклональное антитело к антигену CD20 – ритуксимаб (R). У не леченных ранее пациентов общий ответ от терапии ритуксимабом в монорежиме составляет 51–86 % [9].
В настоящее время комбинированная терапия с флударабином, циклофосфамидом и ритуксимабом (FCR) и в редуцированных дозах (RFClite) является стандартом первой линии лечения ХЛЛ [10].
Таким образом, в настоящее время благодаря анализу полиморфизма систем детоксикации возможно прогнозировать риск развития различных заболеваний. Анализ полиморфизма цитокинов и систем детоксикации ксенобиотиков дает возможность предсказать ответ на химиотерапию у конкретного пациента и патогенетически подходить к выбору линий препаратов, что позволит повысить эффективность лечения ХЛЛ.
Цель исследования: изучение влияния полиморфизмов генов систем детоксикации цитохрома P450 (CYP 1A1, CYP 1A2, CYP 2C9 (*2), CYP 2C9(*3), CYP 2C19, CYP 2E1(PstI/RsaI),CYP2E1(Tag I), CYP 3A4) на терапевтическую эффективность лечения больных с лимфопролиферативными заболеваниями.
Материал и методы исследования
Обследованы 64 больных (40 мужчин, 24 женщины) с ЛПЗ в возрасте от 27 до 76 лет (средний возраст составил 61 год). Всем больным диагностировано лимфопролиферативное заболевание впервые.
Хронический лимфолейкоз диагностирован у 29 пациентов (45%), лимфомы диагностированы у 35 человек (55%): В-клеточная лимфома из малых лимфоцитов – у 19 пациентов (30%), лимфома из клеток зоны мантии – у 7 человек (11%), Т-клеточная лимфома составила 5% (3 человека), В-клеточной лимфомой из клеток маргинальной зоны и волосатоклеточным лейкозом страдали по 2 человека (6%), В-клеточной лимфоплазмоцитарной лимфомой и хроническим В-пролимфоцитарным лейкозом – по 1 человеку.
Диагнозы конкретной нозологической формы верифицировали в соответствии с национальными и международными рекомендациями.
Для статистической обработки в целях получения закономерности у всех больных оценивались параметры: гемоглобин, количество тромбоцитов, лейкоцитов, размеры периферических и внутрибрюшных лимфоузлов, наличие спленомегалии, поражение экстранодальных органов. Полученные данные соответствуют общемировой статистике, согласно которой ХЛЛ и В-клеточная лимфома из малых лимфоцитов составляют 35% всех онкогематологических заболеваний, встречающихся у представителей европеоидной расы всех возрастов.
Из 29 пациентов с диагнозом ХЛЛ стадия «С» по европейской классификации Binet диагностирована у 16 человек, стадия «В» – у 13 человек. Лейкоцитоз более 9,0 тысяч наблюдался у 22 пациентов, гиперлейкоцитоз более 100,0 тысяч – у 5 больных, у 2 человек лейкоциты были в пределах 5,0–8,0 тыс.
При диагностике лимфом применялась классификация Ann Arbon: у всех пациентов с различными лимфомами (35 человек) была диагностирована либо III, либо IV стадия заболевания с поражением и без поражения селезенки и нелимфоидных органов [11]. Лейкемизации процесса у больных не наблюдалось.
На фоне лечения после курсового применения ПХТ, содержащего высокотехнологические препараты мабтера (ритуксимаб), флударабин, а также бендамустин, бортезомиб, этопозид, кладрибин (программы RFC, FC, CHOP-bleo, CHOEP, RB, BDV, CC), полная ремиссия зарегистрирована у 23 больных (36%), частичная ремиссия – у 14 человек (22%), стабилизация опухолевого процесса констатирована у 9 пациентов (16%), прогрессия заболевания наблюдалась у 16 больных (23%), 2 человека (3%) умерли в результате прогрессии тяжелой сопутствующей патологии. Оценку эффективности лечения проводили в соответствии с клиническими рекомендациями по диагностике и лечению ЛПЗ [11].
Определение полиморфизма генов детоксикации проводилось с помощью MALDI-TOF Mass Spectrometry autoflex. Matrix-Assisted Laser Deporption/Ionication time of Flight Mass Spectrometry.
В качестве клинического материала для молекулярно-генетического исследования использовалась венозная кровь (5 мл), взятая в стерильные пластиковые пробирки, с добавлением антикоагулянта этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА). Для выделения геномной ДНК был применен фенол-хлороформный метод («АТГ-Биотех», Россия). Геномную ДНК пациентов использовали для амплификации фрагментов ДНК путем проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующей реакцией мини-секвенирования при помощи набора для идентификации одноточечных нуклеотидных полиморфизмов (ООО НПФ «ЛИТЕХ», Россия), после чего проводили идентификацию генотипов полиморфного маркера на времяпролетном масс-спектрометре (MALDI TOF MC).
Полученные данные подвергались статистической обработке на персональном компьютере с применением прикладной программы «IBM SPSS Statistics 20, США». Достоверность различий между показателями независимых выборок оценивали по непараметрическому критерию Манна–Уитни. Корреляционный анализ проводили с вычислением ранговой корреляции Спирмена (r). Нулевую гипотезу отвергли при уровне статистической значимости p≤ 0,05. Во всех случаях различия сравниваемых величин считали статистически значимыми при уровне p≤ 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
При анализе частот аллелей гена CYP 2С19 фермента цитохрома P450 все пациенты в группе – носители гомозиготного варианта GG. Поскольку в мире нет данных контрольной группы здоровых людей, ассоциировать именно этот вариант гена CYP 2С19 фермента цитохрома P450 с развитием лимфопролиферативного заболевания невозможно.
При анализе частот аллелей гена фермента CYP 1А1 цитохрома P450 у 62 пациентов (97% случаев) выявлен гомозиготный вариант АА данного гена. Данный вариант преобладает и в популяции здоровых людей индоевропеоидной расы [12]. Статистических различий полиморфных генов CYP 1А1 цитохрома P450 получено не было. Было также замечено, что полиморфный вариант гена фермента, носящий аллель, приводит к повышению активности CYP1A1 и служит онкологическим маркером для развития ХМЛ [13]. Интересно пояснить: Цитохром 1А1 является одним из ферментов системы детоксикации организма от ксенобиотиков, переводит полициклические ароматические углеводороды в канцерогенные продукты.
При анализе частот аллелей гена фермента CYP 1А2 цитохрома P450 гомозиготный вариант аллеля АА преобладал и встречался у 38 человек (60%), гетерозиготный вариант (АС) выделен у 21 человека (33%), гомозиготный вариант СС встретился у 5 пациентов, что составило 7% .
При сравнении вариантов аллелей генов CYP 1А2 (табл. 1) с количеством лейкоцитов в периферической крови больных была выявлена ассоциация гетерозиготных аллелей АС этого гена и нормального количества лейкоцитов в периферической крови в 78,3% случаев (р<0,0014). Можно предположить, что у пациентов с гомозиготными вариантами аллелей АА и СС CYP 1A2 следует ожидать прогрессию лимфопролиферативного состояния (ЛПЗ). Полученные данные свидетельствуют о наличии ассоциации гомозиготного варианта аллеля АА гена CYP1А2 с прогрессирующим увеличением лейкоцитов в периферической крови пациентов с ЛПЗ.
Таблица 1
Сравнение вариантов аллелей гена CYP 1А2 с количеством лейкоцитов в периферической крови больных ЛПЗ
|
Лейкоциты крови (n х109 /л) |
АА – гомозиготный аллель Абс. число больных (%) |
АС – гетерозиготный аллель Абс. число больных (%) |
СС – гомозиготный аллель Абс .число больных (%) |
|
|
5,0–8,0 |
2 (11,20%) |
17 (78,30%) |
2 (10,50%) |
р < 0,0014 |
|
Более 9,0 |
13 (35,30%) |
18 (49,60%) |
3 (8,60%) |
p>0,05 |
|
Более 100,0 |
7 (77,80%) |
2 (22,20%) |
0 |
p>0,05 |
Примечание: n – количество лейкоцитов крови; АА, АС, СС – аллели гена CYP 1A2; р < 0,0014 – статистически значимые различия по отношению к группе больных с аллельным вариантом АС гена CYP 1A2.
При сравнении других полиморфизмов генов детоксикации (CYP 1A1, CYP 2C9 (*2), CYP 2C9(*3), CYP 2C19, CYP 2E1(PstI/RsaI),CYP2E1(Tag I), CYP 3A4) с количеством лейкоцитов периферической крови какой-либо закономерности выявлено не было.
При сравнении всех исследуемых генов детоксикации с другими параметрами (такими как гемоглобин, количество тромбоцитов, размеры периферических и внутрибрюшных лимфоузлов, наличие спленомегалии, поражение экстранодальных органов) также не было выявлено какой-либо статистически значимой закономерности.
В структуре аллелей гена CYP 3А4 (табл. 2) фермента цитохрома P450 преобладали гетерозиготные носители (АG) – 38 человек (60%), остальные пациенты были носителями варианта АА (40%), вариант GG среди исследуемых пациентов не встречался. Статистически значимые результаты были получены при оценке ассоциации полиморфных генов цитохрома P450 и эффективности терапии ЛПЗ. В 5 раз чаще удавалось достичь стабилизации процесса на фоне терапии у пациентов с гомозиготными аллелями (АА) гена CYP 3А4 фермента цитохрома P450 (р=0,026). Ассоциации с другими ответами на терапию (частичная ремиссия, полная ремиссия, прогрессия заболевания) с полиморфизмом гена CYP3A4, а также генов CYP 1A1, CYP 1A2, CYP 2C9 (*2), CYP 2C9(*3), CYP 2C19, CYP 2E1(PstI/RsaI) получено не было.
Таблица 2
Оценка ассоциации полиморфизма гена CYP3A4 цитохрома P450 и эффективности терапии больных ЛПЗ
|
Эффективность |
AA – гомозиготный аллель Абс. число больных (%) |
AG – гетерозиготный аллель Абс. число больных (%) |
|
|
Прогрессия |
6 (42,30%) |
10 (57,70%) |
p>0,05 |
|
Стабилизация |
7 (83,30%) |
2 (16,70%) |
р=0,026* |
|
Частичная ремиссия |
5 (21,40%) |
9 (80,50%) |
p>0,05 |
|
Полная ремиссия |
10 (42,30%) |
13 (57,70%) |
p>0,05 |
Примечание: AA, AG – аллели гена CYP3A4 цитохрома P450; * – различия статистически достоверны (р≤0,05)
В структуре аллелей гена CYP 2E1 (Tag I) фермента цитохрома P450 преобладали гомозиготные носители (СС) – 43 человека (67%), 18 пациентов (28%) были носителями варианта CG, вариант GG наблюдался только у 3 больных (5%).
У носителей гетерозиготного набора аллеля (CG) гена CYP 2E1 (Tag I) (табл. 3) статистически значимо (P = 0,044), полных ремиссий на фоне терапии удавалось достичь в 2 раза чаще, чем у больных – носителей гомозиготного аллеля СС. Ассоциации с гомозиготным вариантом GG получено не было.
Таблица 3
Оценка ассоциации полиморфизма гена CYP2E1(Tag I) и эффективности терапии больных ЛПЗ
|
Эффективность |
CC-гомозиготный аллель Абс. число больных (%) |
CG-гетерозиготный аллель Абс. число больных (%) |
GG-гомозиготный аллель Абс. число больных (%) |
|
|
Прогрессия |
10 (52,90%) |
4 (23,50%) |
2 (23,60%) |
p>0,05 |
|
Стабилизация |
4 (50,00%) |
3 (43,70%) |
2 (6,30%) |
p>0,05 |
|
Частичная ремиссия |
11 (85,70%) |
3 (7,10%) |
0 |
p>0,05 |
|
Полная ремиссия |
7 (33,30%) |
15 (62,50%) |
1 (4,20%) |
р=0,044* |
Примечание: CC, CG, GG – аллели гена CYP2E1(Tag I); * – различия статистически достоверны (р≤0,05)
Статистически значимой ассоциации полиморфизмов генов CYP 1A1, CYP 1A2, CYP 2C9 (*2), CYP 2C9(*3), CYP 2C19, CYP 2E1(PstI/RsaI) и эффективности терапии больных ЛПЗ получено не было. Однако из-за ограниченного размера выборки наши результаты должны быть проверены в крупномасштабных исследованиях.
Заключение
Генотип гетерозиготного аллеля AC гена CYP 1A2 больных с ЛПЗ ассоциирован с нормальным уровнем лейкоцитов. Увеличение числа лейкоцитов и прогрессию ЛПЗ можно ожидать у носителей гомозиготного варианта аллелей АА и СС этого гена.
У носителей гомозиготных аллелей АА гена CYP 3A4 больных ЛПЗ в 5 раз чаще наблюдалась стабилизация процесса в ответ на проводимую терапию по сравнению с носителями гетерозиготных аллелей АG.
У носителей генотипа CG гена CYP 2E1 (Tag I) больных ЛПЗ полная ремиссия наблюдалась в 2 раза чаще, чем у носителей генотипа CC.
Таким образом, возможна ассоциация полиморфизмов генов CYP 1A2, CYP 3A4, CYP 2E1 (Tag I) с характером проявлений, течением ЛПЗ и эффективностью проводимой терапии. Полиморфизм данных генов можно рассматривать в качестве потенциального маркера клинической картины и эффективности терапии ЛПЗ.
Полиморфизм генов CYP 1A1, CYP 2C9 (*2), CYP 2C9(*3), CYP 2C19, CYP 2E1(PstI/RsaI) скорее всего не влияет на характер клинического течения и эффективность лечения ЛПЗ.