В последнее десятилетие особый интерес исследователей сконцентрирован на изучении роли дисфункции эндотелия в патогенезе сосудистых осложнений при многих патологиях: сахарном диабете, метаболическом синдроме, токсических влияниях, ИБС, патологии беременности и др. Особое внимание авторами уделяется изучению функции эндотелия и его участию в реализации патологических синдромов. Более того, изучение механизмов эндотелиальной дисфункции позволяет разработать патогенетически обоснованные методы фармакологической коррекции [1; 2]. Однако, обобщая литературные данные, надо определить механизмы участия эндотелиальных клеток в регуляторных процессах посредством выработки вазоактивных веществ: оксида азота, эндотелина, ангиотензина I, возможно и ангиотензина II, простациклина, тромбоксана [3; 4]; участие в гемокоагуляции и активации фибринолиза; в реакциях врожденного и приобретенного иммунитета; выполнение ферментативной функции - экспрессии ангиотензинпревращающего фермента (АПФ); в регуляции пролиферативных процессов гладкомышечной клетки (ГМК) и ее сократительной функции, обеспечении функции защиты от вазоконстрикторных влияний и т.д.
Целью исследования является анализ данных литературы применительно к регуляции функции эндотелия в условиях патологии.
Истощение регуляторных механизмов приводит к дисфункции эндотелия, в развитии которой участвует ряд биохимических систем: ПОЛ – АОС, NO-образующая функция, нарушение в орнитиновом цикле, сопровождающееся гиперактивностью фермента аргиназы [5]. Причины, приводящие к этим негативным влияниям, многообразны, и к ним можно отнести токсические ситуации в организме. Они могут быть вызваны экопатогенными факторами, в частности тяжелыми металлами [6].
По многочисленным литературным данным известно о преимущественной способности накопления тяжелых металлов почками при их избыточном поступлении в организм [7-9]. Цитотоксичность определяется активацией липопероксидации, угнетением антиокислительной системы в клетках, действием на метаболизм оксида азота и нарушением эндотелиальной функции сосудов. Изучение патогенетических механизмов развития токсического действия позволит дать обоснование к использованию для предупреждения и лечения патологических проявлений ингибиторами липопероксидации и веществами, влияющими на равновесие эндотелиальной и индуцибельной NOS. Действие оксидантов на клетки эпителия приводит к нарушению гидрофобности мембран эндотелиоцитов, повышению их проницаемости, снижению активности энергообразующих ферментов, снижению активности цитохром-С-оксидазы, НАД-зависимых дегидрогеназ, АТФ-азы и СДГ [3; 10]. Основной мишенью для токсического действия солей цветных металлов служат энергетические станции клеток (митохондрии). Об этом свидетельствуют структурные изменения во внутренних органах: печени и почках экспериментальных животных при их воздействии [5; 11]. Негативные изменения в митохондриях при токсическом воздействии приводят к уменьшению энергообразования, снижению соотношения АТФ/АДФ, угнетению активности АТФ-аз, в частности Na+-К+- активируемой [5; 11]. Липопероксидация оказывает влияние на качественные изменения клеточных мембран клубочково-канальцевого аппарата. Изменения происходят в толстом восходящем колене петли Генле, где функционирует натриевый насос. Таким образом, натрий транспортирующий механизм, включающий Na,K-зависимую АТФ-азу, влечет изменения трансмембранного переноса ионов в нефроне [3; 12].
Степень активности окислительного стресса зависит от нарушения в антиокислительной системе. Она обеспечивается ферментами супероксиддисмутазой (СОД), каталазой, глютатионпероксидазой, глютатионредуктазой и др. СОД находится в цитозоле и органоидах, включая силовые станции, т.е. митохондрии. Экстрацеллюлярная (ЕС) СОД располагается и на поверхности эндотелиальных клеток в экстрацеллюлярном пространстве, а также содержится в плазме и сыворотке крови, синовиальной жидкости, моче [13; 14]. СОД эритроцитов принадлежит к периферическим белкам клеточной мембраны. Энзим фиксируется на мембране ионными связями. Экстрацеллюлярная локализация фермента предполагает возможность её дисмутазной активности в плазме и сыворотке крови.
Другим важным ферментом антиокислительной защиты – второй линии АОЗ, является каталаза (кф 1.11.1.6.), оксидоредуктаза, которая относится к хромопротеидам. Она состоит из 4 мономеров, имеющих в составе железопротопорфирин IX, железо, которое не изменяется в ходе ферментативной реакции. Известно 2 изоформы каталазы: мембранная и цитоплазматическая, но ее активность определяется в плазме крови.
Церулоплазмин обладает антиокислительными свойствами, восстанавливает О2- до О2 и Н2О, т.е. обладает СОД-активностью, но в отличие от СОД функционирует только в плазме крови; перехватывает свободные радикалы кислорода и тем самым предохраняет от их повреждающего действия липидсодержащие биоструктуры. Он является универсальным внеклеточным «чистильщиком» свободных радикалов. Т.о., патогенетической основой развития эндотелиальной дисфункции и патологии висцеральных систем при токсических воздействиях (тяжелые металлы) является нарушение в сопряженной системе ПОЛ - АОС.
Нарушение функции эндотелия в условиях окислительного стресса может быть обусловлено либо сниженной продукцией эндотелиальными клетками (эк) вазодилататоров оксида азота (NO): простациклина, фактора гиперполяризации, натрийуретического пептида С – типа (НПС), адреномедуллина [15; 16]. В свою очередь, сниженная продукция NO – основного сосудорасширяющего вещества, может быть обусловлена низкой экспрессией эндотелиальной NO-синтазы (eNOS), с его пониженной активностью или ускоренным распадом NO. Реакция оксида азота перехватывает супероксиданион радикал (О2-), и эта реакция перекрывает дисмутацию, вызываемую функционированием супероксиддисмутазы (СОД). Повреждающим фактором при этом оказывается образующийся пероксинитрит [17; 18]. Следует отметить, что нарушения проявляют системно-органный характер.
Оксид азота привлекает особое внимание исследователей, поскольку это сигнальная молекула и модулятор-мессенджер клеточного ответа в различных тканях. Он вырабатывается в сосудистой системе эндотелиальными клетками в реакции окисления L-аргинина NO-синтазой (NOS-3) [19-21]. Азотсодержащая группа R-цепи L-аргинина, относящегося к группе полунезаменимых аминокислот, является источником атома азота [14; 22; 23]. Субстрат был впервые идентифицирован в 1886 году, а структура окончательно утверждена в 1910 году [20]. Так как L-аргинин является предшественником оксида азота, то в последние годы его значимость возросла [16; 24]. Рекомендуемая физиологическая суточная норма L-аргинина составляет 5,4 г, и только 1/2 часть поступившего аргинина поступает в циркуляцию [23]. В плазме крови человека и животных содержание L-аргинина варьирует в пределах 95-250 мкмоль/л, зависит от возраста и пищевого рациона, а его количество в ЭК сосудов зависит от структурной организации сосудистой стенки, активности мембраносвязанной транспортной системы и др. В клетке недостаток L-аргинина восполняется при метаболическом распаде белков и через L-цитролиновый цикл с участием аргиназы, превращающей его в орнитин и мочевину [25]. Аргиназа изоформа I является конститутивной, а изоформа аргиназа II стимулируется в эндотелиоцитах цитокинами и липополисахаридами [26].
На концентрацию клеточного L-аргинина влияют интерлейкины: ИФ-γ и ИЛ-1β, ускоряющие доступ L-аргинина внутрь клеток и повышающие активность аргининосукцинатлиазы, катализирующей реакцию образования L-аргинина из промежуточного продукта реакции L-цитруллина [26-28]. Цитокины (ИЛ-4 и ИЛ-10) в противоположность этому стимулируют аргиназу и соответственно уменьшают доступность L-аргинина – донора оксида азота.
Модифицированные производные L-аргинина конкурентно тормозят продукцию NO [22]. Заметим, что одни из них являются селективными (N-омега-циклопорил-L-аргинин), а другие неселективными для iNOS (аминогуанидин). Неселективные модифицированные производные L-аргинина: N-нитро-L-аргининметиловый эфир (L-NAME), N-монометил-L-аргинин (L-NMMA), N-нитро-L-аргинин (L-NNA) тормозят образование NO. Содержание оксида азота регулируется NO-синтазами: индуцибельной (iNOS,) и эндотелиальной (NOS-2, NОS-3). Они состоят из субъединиц одинаковой по молекулярной структуре, каждая из которых включают по 2 реагирующих участка. На аминном конце цепи имеется гемсвязывающий, а на карбоксильном конце - кальмодулин-связывающий [26; 29]. Они синтезируют NO в небольшом количестве либо непрерывно, или стимулированно, малыми порциями, под влиянием факторов, которые действуют через рецепторы, но могут и не зависеть от этих рецепторов. В регуляции тонуса сердечно-сосудистой системы особо важную роль играет эндотелиальная NOS (NOS-3) [27; 30]. Нейрональная NO-синтаза ответственна за регуляцию процесса пролиферации и созревания нейронов ЦНС, а также за процесс регенерации после повреждений мозга в результате ишемии [21].
Играет роль базальный уровень оксида азота, продуцируемый еNOS-синтазой. Функциональное состояние NOS-1 и NOS-3 регулируется конформационными изменениями молекулы.
Физиологический уровень концентрации NO образуется за счет эндотелиальной NOS-3 и регулирует равновесие между вазокострикторами и вазодилататорами, т.е. сосудистый тонус. В формировании сосудистых осложнений, в том числе патологии сердца, определяющая роль отводится нарушенной продукции оксида азота NOS-3. Функциональная активность eNOS зависит в определенной степени от ее локализации. Мембраносвязанная форма энзима способна взаимодействовать с рецепторами, что повышает клеточную концентрацию кальция. Это способствуют освобождению eNOS от кавеолина и ее активации [2; 21; 26].
Мембраносвязанная форма фермента существенна для подачи сигнала в случае давления на барорецепторы сосудов. Это может происходить при увеличении скорости кровотока, при различных состояниях организма с пониженным содержанием кислорода в крови.
Активаторами для энзима является ряд факторов: возрастание концентрации внутриклеточного кальция и усиление его проникновения в клетку, а также напряжение и индукция калиевого тока. Причиной повышения функциональной активности NOS-3 является вазоконстрикция, а также тромбоцитарные рецепторы (ФАТ) при повышении их активности. Продуцируемый NO диффундирует довольно легко в цитоплазму гладкомышечных клеток, играет роль мессенджера и запускает через гуанилатциклазу образование 3,5цГМФ. Через определенную совокупность химических реакций открываются К+Са-каналы и усиливается трансмембранный перенос калия, что приводит к гиперполяризации мембраны. Угнетается транспортный механизм Са2+ через ион-селективные каналы, и снижение его концентрации сопровождается расслаблением гладкомышечных клеток. Эндотелиальная NOS образуется в эндотелиоцитах, тромбоцитах. Энзим может также активироваться Ca2+, AMP-зависимой протеинкиназой А, а также сердечным шоковым протеином-90 [31].
Поскольку достоверно не установлена причина снижения доступности L-аргинина, тем не менее новые аргументы указывают на предположение о том, что в этот процесс со стороны аргиназы, вероятно, вовлекается катаболизм L-аргинина. Аргиназа - двуядерный марганцевый металлофермент, катализирующий гидролиз L-аргинина до L-орнитина и мочевины. В организме высокоорганизованных животных обнаружены 2 изоформы, которые кодируются разными генами. Основная изоформа аргиназы I находится в цитоплазме гепатоцитов и экспрессируется в них, но также выявлена в эритроцитах, в ткани молочной железы в период лактации. Изоформа II в основном экспрессируется в органах выделения – в почках, а также в простате и частично в гепатоцитах [32]. Исследованиями последних лет установлено ее образование и наличие в сосудистой системе. Такими структурами оказываются ГМК аорты. Однако следует заметить, что эта аргиназа использовалась в орнитиновом цикле. Подавление энзима – аргиназы II или использование сред с L-аргинином сопровождалось повышением содержания NО. Эти данные свидетельствуют о важной роли аргиназы в патогенетических механизмах. Существуют данные, что гиперэкспрессия обеих изоформ аргиназы приводит к снижению содержания L-аргинина в эндотелиальной клетке. Это сопровождается нарушением гемодинамики вследствие вазоконстрикции сосудов микроциркуляции [32]. Исследования генетической программы экспрессии аргиназ подтверждает положение об ингибирующей их роли в продукции NO и регуляции сосудистого тонуса. В эксперименте на мышах с нокаутом гена обоих аргиназ имеет место значительное возрастание L-аргинина в крови [32]. Эти данные подтверждают важную роль обеих аргиназ в регуляции содержания субстрата L-аргинина и оксида азота [32]. Свое участие в регуляцию гомеостаза оксида азота вносит оксидативный стресс, при котором может повышаться активность аргиназ, так как реагирующие чувствительные элементы выявлены в промоторной части этих энзимов [32].
Ишемия-реперфузия сосудов миокарда угнетает синтез NО артериолами и соответственно эндотелийзависимую вазодилатацию. Выявлено, что это может быть связано с воспроизведением аргиназы и ее активности. Более того, торможение аргиназы и прибавка L-аргинина может восстанавливать синтез NО и сосудорасширяющую функцию [33]. Установлено, что гипергликемия способствует активации аргиназы, и это может приводить к эндотелиальной дисфункции при ожирении и диабете [15]. При этих патологиях роль стимулятора уровня экспрессии аргиназы II играет оксидативный стресс [32].
На основании изложенных данных литературы и собственных исследований возникает идея о необходимости коррекции дисфункции эндотелия препаратом, обладающим антиоксидантным, мембранотропным свойством и способным регулировать взаимодействие между eNOS и iNOS.
Препаратом выбора является коэнзим Q10 (убихинон) - жирорастворимое витаминоподобное вещество из класса бензохинонов. Коэнзим Q10 был извлечен из митохондрий кардиомиоцитов быка Ф. Крейном в 1957 г., а в 1958 г. исследованиями К. Фолкерса определена его структура. С открытием дыхательной цепи была установлена роль убихинона в транспорте электронов в «силовых станциях» клетки (митохондриях). В отличие от других составляющих цепи переноса электронов коэнзим Q10 легко свободно мигрирует во внутренней мембране митохондрий и забирает электроны не только от переносчиков дыхательной цепи, но и из других областей. Он всегда в процессе функционирования переходит из окисленного состояния в восстановленное и наоборот, поскольку постоянно осуществляет транспорт электронов и протонов. Он тесно взаимодействует с α-токоферолом и способствует поддержанию его восстановленной формы, что очень важно для метаболических процессов. Основное участие коэнзима Q10 востребовано на завершающем этапе аэробного окисления глюкозы, жирных кислот и углеродных скелетов аминокислот. Синтез коэнзима Q10 может осуществляться из аминокислоты тирозина при кофакторах из витаминов группы В и микроэлементов. С другой стороны, он может образовываться из мевалоната – промежуточного предшественника синтеза холестерина. Наиболее востребован коэнзим Q10 в миокарде, что обусловлено потребностью аэробного окисления в нем [33-35]. Однако в токсических условиях его участие в литературе представлены весьма недостаточно.
Исследования, проведенные в нашей лаборатории, продемонстрировали выраженные антиоксидантные свойства коэнзима Q10 в условиях интоксикации тяжелыми металлами и при других метаболических нарушениях. Данные показали существенное ингибирование липопероксидации в эритроцитах при различных патологических состояниях: экспериментальном сахарном диабете (ЭСД), интоксикации тяжелыми металлами, ИБС [3; 14]. Эффективность коэнзима Q10 возрастает в комплексе с L-аргинином – донором NO [30]. Установлено, что коэнзим Q10 способствует возрастанию активности СОД и снижению повышенной активности каталазы и концентрации церулоплазмина.
Во всех исследованиях повышение активности СОД под влиянием коэнзима Q10 приводит к угнетению супероксид-анион-радикала и одновременно снижению образования перекиси водорода (Н2О2) - субстрата для каталазы [14; 34]. У экспериментальных крыс с ЭСД, кобальтовой интоксикацией и у больных ИБС – II ФК. При этом содержание оксида азота возрастает [14; 30].
Следовательно, изучаемые препараты оказывают позитивное влияние на биохимические показатели и функциональное состояние эндотелия сосудов. На фоне устранения дисбаланса в системе СРО - АОС происходило одновременно индуцирование образования NO. Снижение продукции NO в эксперименте устранялось на фоне убихинона. Возможно, это было связано с повышением биодоступности субстрата L-аргинина для eNOS, снижением в крови эндогенного ингибитора eNOS–АДМА. Этот регулятор – коэнзим Q10 влияет на воспроизведение еNOS и биодоступность NO [3; 14].
Следует отметить, что доступность оксида азота зависит от наличия окисленных ЛНП (оЛНП). Установлено данными нашей лаборатории, что у затравленных крыс на фоне лечения коэнзимом Q10 и L-аргинином происходит достоверное снижение концентрации ОХС, повышение ХС ЛВП и значительное снижение ХС в ЛНП, р<0,001. Одновременно снижается и концентрация ТАГ. Такое влияние атерогенных ЛП в условиях окислительного стресса подтверждается корреляционным анализом, полученным в нашей лаборатории [18]. Следовательно, коэнзим Q10, ингибируя липопероксидацию, нормализуя обмен ХС, т.е. снижая содержание ХС ЛНП и повышая ХС ЛВП, улучшает биодоступность субстрата L-аргинина к своему ферменту и соответственно индуцируется продукция суммарных метаболитов NO. Наши данные позволяют утверждать, что коэнзим Q10, сам по себе и в комбинации с L-аргинином, оказывает влияние и на уровень экспрессии eNOS. В исследованиях Дзугкоева С.Г. и соавт. установлено повышение уровня экспрессии eNOS при экспериментальном сахарном диабете [14; 30].
Заключение. Окислительный стресс влияет на NO-продуцирующую функцию эндотелия, зависимую от наличия субстрата синтеза NO – L-аргинина, его биодоступности для ГМК клетки сосудов, восстановленного состояния коферментов eNOS, уровня ее экспрессии и активности. С другой стороны, свое участие в эту регуляцию вносит фермент орнитинового цикла - аргиназа. Коэнзим Q10 проявляет выраженное АО, мембранотропное действие, влияет на интенсивность ПОЛ, продукцию оксида азота, стимулируя эндотелиальную NO – синтазу. С другой стороны, коэнзим Q10 по принципу конкурентного ингибирования синтеза ХС способствует предотвращению атерогенных изменений в эндотелии сосудов, способствуя при этом повышению биодоступности L-аргинина для eNOS.