Scientific journal

Modern problems of science and education

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

Экспериментальные исследования функций почек в условиях различных патологических состояний позволяют вскрывать ранее неизвестные механизмы, лежащие в основе тех или иных заболеваний, что в перспективе может быть востребовано при разработке способов лечения нефрологических больных. Несмотря на то что основной функцией почек является мочеобразовательная, они также поддерживают постоянство внутренней среды организма благодаря тонкой и точной регуляции основных процессов мочеобразования, во многом зависящих и от гормонального влияния, и от авторегуляции [1-3]. Образование окончательного объёма мочи в основном обусловлено канальцевой реабсорбцией воды, а она связана с осмолярностью интерстиций, создаваемой осмотически активными веществами, в первую очередь натрием и мочевиной [4-6]. Однако о величине обратного всасывания воды в канальцах почек можно судить более обоснованно и с большей точностью по уровню в плазме крови антидиуретического гормона – основного регулятора всасывания воды в дистальных канальцах и собирательных трубочках [7; 8].

Цель исследования: исследование состояния электролитно-мочевинного профиля ткани почек крыс с экспериментальной почечной недостаточностью для выяснения механизмов водовыделительной функции в этих условиях.

Материалы и методы исследования. Исследования проводили на 62 крысах линии Вистар. Контрольную группу, состоящую из 20 интактных животных, разделили на две равные подгруппы: с водной нагрузкой и без таковой (спонтанный диурез). Опытную группу, состоящую из 42 животных, также разделили на две равные подгруппы, в одной из которых крысы получали водную нагрузку (водопроводную воду в объёме 5,0% их массы тела), а в другой – питьевой режим сохранялся по потребности, определяющей объём спонтанного диуреза (подгруппа «спонтанного диуреза»).

Модель почечной недостаточности создавали путём внутримышечного введения крысам 50,0%-ного раствора глицерина в дозе 0,8 мл/100 г массы тела [9]. При постановке экспериментов исходили из того, что обмен веществ у крыс значительный, что способствует более ускоренному течению всех процессов и нормализации патологических состояний, а нефротоксическое действие однократного введения глицерина уже через две недели после введения ослабевает и практически заканчивается в течение месяца. В наших же планах было выяснение механизмов водовыделительной функции почек в течение трёх месяцев, то есть в условиях острого и хронического течения почечной недостаточности. В связи с этим через две недели после начала эксперимента животным повторно вводили глицерин в аналогичной дозе, а третий раз инъекцию глицерина делали спустя один месяц после первой инъекции.

Во время сбора мочи крыс сразу же после введения им водной нагрузки на три часа помещали в большие пластиковые воронки с закрытой крышкой и мочеприёмником (выделяющуюся мочу собирали отдельно каждый час). При проведении опытов со сбором спонтанного диуреза у животных моча собиралась в течение шести часов. В собранной моче спектрофотометрически (спектрофотометр UNICO 2000, США) определяли содержание мочевины с помощью стандартного набора фирмы «Лахема».

В слоях ткани почек определяли содержание мочевины и натрия: мочевины этим же набором после гомогенизации образцов, а натрия – после предварительного высушивания образцов, их растирания в порошок, экстрагирования иона 0,75 н раствором азотной кислоты и последующего определения его содержания методом пламенной фотометрии (ПФА-378, Россия) [10].

Так как исследования проводили три раза, то каждый раз для изучения осмолярности слоёв ткани почек и определения содержания мочевины в плазме крови забивали по 7 крыс в условиях полного обезболивания и состояния искусственного сна, вызванных внутрибрюшинным введением 0,2 мл золетила – анестетика общего действия (Франция). Подготовку и проведение опытов осуществляли согласно Приказу Министерства здравоохранения РФ «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики» от 01.04.2016 г. № 199н (зарегистрирован в Минюсте РФ 15.08.2016 г. № 43232). При утилизации крыс, выведенных из экспериментов, исходили из Приказа Минсельхоза РФ «Ветеринарно-санитарные правила сбора, утилизации и уничтожения биологических отходов» от 16.08.2007 г. № 400.

Полученные результаты были подвергнуты статистической обработке с использованием программы GraphPad Prizm 6.01. При проведении статистической обработки полученных данных, исходя из того что количество животных в каждой из подгрупп было не столь значительным, мы отдали предпочтение методу Манна-Уитни. Данные считали достоверными при р < 0,05.

Разрешение для проведения данных экспериментальных исследований на животных было получено этическим комитетом ГБОУ ВПО «Северо-Осетинская государственная медицинская академия» Минздрава России 09 декабря 2014 года, протокол № 4.5.

Результаты исследования и их обсуждение. Ранее нами при выяснении чувствительности V2-рецепторов канальцевого аппарата к антидиуретическому гормону у крыс с почечной недостаточностью, вызванной введением глицерина [11], было показано, что после водной нагрузки наиболее выраженные изменения диуреза, клубочковой фильтрации и канальцевой реабсорбции воды наблюдались через две недели и один месяц после создания модели, а в условиях спонтанного диуреза – через одну неделю и месяц после введения крысам глицерина [12]. Как при водном, так и спонтанном диурезе отмеченные изменения через три месяца стали приближаться к норме. Поэтому состояние электролитно-мочевинного профиля слоёв ткани почек исследовали в это же время.

Через 7 дней после инъекции глицерина содержание мочевины и натрия во всех слоях почек крыс подгруппы «спонтанного диуреза» особо не отличалось от контрольных данных (таблица 1). А раз электролитно-мочевинный профиль не менялся, то неизменным остаётся осмотическое давление и, соответственно, канальцевая реабсорбция воды, а отмеченное нами ранее [11] снижение диуреза было обусловлено ослаблением скорости клубочковой фильтрации, а не изменением канальцевой реабсорбции.

Таблица 1

Уровни мочевины (мкмоль/г влажного веса) и натрия (мкмоль/г сухого веса) в слоях почек при спонтанном состоянии диуреза и после водной нагрузки

Спустя месяц с момента создания модели почечной недостаточности, когда у крыс отмечалась наиболее выраженная полиурия, обусловленная как ускорением клубочковой фильтрации, так и снижением канальцевой реабсорбции воды, содержание мочевины и натрия в ткани слоёв почек было меньше, чем у интактных крыс. Уровень мочевины в корковом веществе опустился до 27,26±0,72 мкмоль/г влажного веса (р˂0,01), натрия до 24,76±0,60 мкмоль/г сухого веса, а в мозговом веществе – на 12,8% (р˂0,02) для мочевины и на 15,9% (р˂0,01) для натрия. Примерно в таком же объёме произошло их снижение в почечном сосочке (на 10,1% для мочевины и на 11,0% для натрия). Эти изменения содержания мочевины и натрия в слоях ткани почек способствуют снижению осмотического давления и канальцевой реабсорбции воды, что и вызывает полиурию.

При завершении экспериментов в конце третьего месяца в корковом веществе содержание мочевины и натрия не отличалось от нормы. В мозговом веществе и почечном сосочке уровень мочевины продолжал оставаться статистически значимо сниженным, в то время как уровень натрия был соразмерен контролю (таблица 1). Однако при этом градиент содержания мочевины в слоях почек (меньше в корковом веществе, больше в мозговом и ещё больше в почечном сосочке) сохранялся. Так, если у интактных крыс уровень мочевины в корковом веществе был 31,78±0,91 мкмоль/г влажного веса, в мозговом – 62,77±2,09 и в почечном сосочке 189,3±6,13 мкмоль/г влажного веса и если уровень в корковом веществе принять за 1, то соотношения между этими показателями составят 1 : 1,99 : 5,96. В условиях почечной недостаточности через одну неделю после начала эксперимента уровни мочевины в указанных слоях почек соотносятся как 1 : 1,97 : 5,94, через один месяц – 1 : 2,0 : 6,13 и через три месяца – 1 : 1,83 : 5,59.

Таким образом, у крыс с глицериновым токсическим поражением почек в условиях спонтанного диуреза изменения содержания мочевины и натрия в слоях ткани почек вызывают колебания осмотического давления, способствующие ослаблению канальцевой реабсорбции воды, что и будет приводить к увеличению диуреза, но при этом разница в содержании мочевины в слоях почек сохраняется.

В условиях водной нагрузки через один час после внутрижелудочного введения водопроводной воды электролитно-мочевинный профиль ткани слоёв почек выглядел следующим образом. При олигурической форме острой почечной недостаточности в конце второй недели в корковом и мозговом веществах почек содержание мочевины и натрия не отличалось от результатов контрольной группы (таблица 1), а в почечном сосочке уровень мочевины был снижен (163,00±4,34 мкмоль/влажного веса в опытной группе; 177,26±5,29 мкмоль/влажного веса в контроле; р˂0,05), а натрия – наоборот, повышен (99,71±3,18 мкмоль/сухого веса в опыте; 77,33±2,49 мкмоль/сухого веса в контроле; р˂0,05). Очевидно, что эти разнонаправленные изменения уравновесили осмотическое давление в слоях ткани почек, поэтому канальцевая реабсорбция воды в это время не изменялась [11].

В конце первого месяца электролитно-мочевинный профиль почек во всех слоях был снижен, что и должно было стать причиной ослабления канальцевой реабсорбции воды, а при завершении опытов, по прошествии трех месяцев после введения глицерина, достоверных изменений в образцах слоёв почек не было выявлено (таблица 1).

Что могло менять содержание мочевины в слоях ткани почек? Очевидно, её уровень в плазме крови и скорость почечного кровотока в прямых сосудах юкстамедуллярных нефронов, в которых, в зависимости от скорости кровотока, усиливается или ослабляется вымывание мочевины из интерстициальной ткани [12]. В 2014 году в нашей лаборатории инвазивным доплерометрическим методом (Transonic HT 313, США) было показано, что у крыс с острой почечной недостаточностью происходит ослабление скорости почечного кровотока [13].

Определение содержания мочевины в плазме крови выявило её повышение уже через две недели (5,59±0,31 ммоль/л – опытная группа; 4,52±0,18 ммоль/л – контроль; р˂0,01), а дальше оно нарастало (через один месяц – 6,90±0,29 ммоль/л, р˂0,001; в конце второго и третьего месяцев соответственно 7,10±0,42 и 8,42±0,56 ммоль/л; р˂0,001). Такое повышение уровня мочевины в крови может способствовать нарастанию её содержания в интерстициальной ткани, что также усиливается действием вазопрессина, способствующего выходу мочевины из собирательных трубочек в интерстиций [12].

Относительно экскреции мочевины с мочой (таблица 2) было выявлено, что в условиях спонтанного состояния уже с первой недели происходит постепенное её повышение (максимально в конце первого месяца). В конце второго месяца выведение мочевины с мочой стало близко к результату контроля, а к моменту завершения опытов, в конце третьего месяца, меньше (р˂0,05). При водном диурезе экскреция мочевины максимальна в конце первой недели, оставаясь повышенной ещё одну неделю, а далее – снижается (таблица 2).

Таблица 2

Экскреция мочевины (мкмоль/час/100 г) в условиях водного и спонтанного диуреза

Одним из характерных признаков почечной недостаточности является уменьшение соотношения экскреции мочевины к её содержанию в плазме крови [14; 15]. Так, у контрольных крыс в условиях водного диуреза за три часа оно составляло 55:1 (251,69±11,3 мкмоль/3 часа/100 г – экскреция мочевины, 4,52±0,18 ммоль/л – содержание в крови). У крыс с почечной недостаточностью это соотношение в течение двух недель держалось, как у контрольных (56:1 – в конце первой недели и 55:1 – в конце второй), но затем начало уменьшаться (32:1 – в конце первого, 28:1 – второго и 24:1 – третьего месяца).

В условиях спонтанного диуреза, когда после введения глицерина прошла одна неделя, соотношение экскреции мочевины к её содержанию в крови составляло 49:1, а при завершении опытов – 20:1. То есть как в условиях водного, так и спонтанного диуреза отмечается уменьшение соотношения этих показателей более чем в два раза.

Заключение. Создание на лабораторных крысах линии Вистар экспериментальной модели почечной недостаточности путём трехкратного в/м введения 50,0% глицерина в дозе 0,8 мл/100 г и проведение опытов в условиях спонтанного и водного диуреза в течение трех месяцев (через одну и две недели, в конце первого, второго и третьего месяцев) выявило нарастающее повышение содержания мочевины в плазме крови (в 1,86 раза больше исходного уровня в конце третьего месяца). Одновременно менялась экскреция мочевины, которая в условиях спонтанного диуреза сначала повышалась в течение одного месяца, а затем снизилась (при водном диурезе увеличение было только в течение двух недель, а затем экскреция мочевины снизилась). При завершении экспериментов в конце третьего месяца более чем в два раза уменьшилось соотношение экскреции мочевины к её содержанию в плазме крови, что является одним из характерных признаков хронической почечной недостаточности. Электролитно-мочевинный профиль слоёв ткани почек крыс по содержанию мочевины и натрия при почечной недостаточности в условиях как спонтанного, так и водного диуреза в конце первого месяца снизился, что способствовало ослаблению в них осмотического давления и, соответственно, канальцевой реабсорбции воды, вызывая полиурию. При завершении экспериментов в конце третьего месяца содержание мочевины и натрия не отличалось от нормы.