Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

DDPCR SCREENING FOR THE MUTATIONAL STATUS OF THE BRAF AND KRAS GENES IN PATIENTS OF SOUTHERN RUSSIA

Vodolazhskiy D.I. 3 Gudkov G.V. 3 Filippov E.F. 1 Murashko R.A. 2 Krutenko D.V. 3
1 Kuban State Medical University of the Ministry of Health of Russia
2 Krasnodar Clinical Oncologic Dispensary №1
3 Children's City Clinical Hospital of Krasnodar
Melanoma of the skin is among the ten most dangerous malignant diseases of a person with high rates of morbidity, high risk of metastasis and mortality, especially in countries with white populations living in regions with a high level of insolation. The overwhelming majority of clinical tests to detect activating somatic mutations are performed at the sensitivity level of traditional RT-PCR methods (1-5%). For the screening of mutations that are beyond the detection of routine research methods, the mutational status of the KRAS gene is determined by the ddPCR method. DNA preparations were obtained from skin biopsies (FFPE) of 36 patients in southern Russia with melanoma and benign skin tumors. With the use of the V600E kit (“Biolink”, Russia), primary screening of patients for groups with no (WT) and the presence (MT) of activating mutations in the BRAF gene was conducted for a 5% sensitivity level. Molecular genetic testing of the activating mutations of V600E, V600K and V600R in exon 15 of the BRAF gene and in exon 2 of the KRAS gene (G12A, G12C, G12D, G12R, G12S, G12V and G13D) was carried out using multiplex ddPCR kits (“Bio-rad”, USA) for a sensitivity level of mutation detection of 0.05%. In patients with benign skin tumors, activating mutations in the KRAS and BRAF genes were not detected using the highly sensitive ddPCR method. In patients with skin melanoma and the presence of activating mutations in the BRAF gene with a frequency of up to 40%, activating mutations in the KRAS gene are detected. In patients with no mutations in the BRAF gene in skin melanoma samples, activating mutations in the KRAS gene are detected with a frequency of up to 80%. All detected mutations were beyond the sensitivity of routine RT-PCR methods. It is concluded that the detection of activating mutations in targeted genes is necessary using more sensitive detection methods.
ddpcr
melanoma
KRAS
braf
somatic mutation

Злокачественная меланома является одним из самых смертоносных и наиболее распространенных видов рака в кавказоидных популяциях, находящихся в условиях интенсивной инсоляции, что особенно характерно для Юга России [1]. До 2011 года диссеминированная меланома с относительно низкой эффективностью лечилась цитотоксическими препаратами, которые не могли улучшить показатели общей выживаемости. В последние годы лечение онкологических заболеваний улучшилось благодаря появлению персонализированных таргетных методов лечения. Это вызвало необходимость проведения рутинных молекулярно-генетических исследований опухолей на предмет наличия/отсутствия клинически значимых соматических мутаций [2-4]. В настоящее время проводится терапия меланомы кожи с использованием BRAF-ингибиторов [5], ингибиторов MEK (митоген-активируемых протеинкиназ), иммунотерапевтических подходов [6] и дендритно-клеточных вакцин [7].

Канонически, RAS-зависимые механизмы димеризации RAF являются одной из причин лекарственной устойчивости клеток меланомы  [8; 9]. Возникновение активирующих соматических мутаций в гене KRAS можно рассматривать в качестве фактора, способствующего усилению RAF-димеризации даже без наличия активирующих соматических мутаций в генах семейства RAF. Частота проявляемости RAS-мутаций в клетках опухолей меланомы, детектируемая рутинными методами RT-PCR с чувствительностью от 1 до 5%, относительно низка. Это может объясняться тем, что титр содержания мутантных вариантов генов RAS, как правило, ниже уровней чувствительности рутинных методов детекции RT-PCR. Однако количество клеток с активирующими мутациями в генах RAS может увеличиться после создания селективных условий для их отбора при использовании таргетных препаратов, элиминирующие клетки-носители активирующих RAF-мутаций. Поэтому успешная детекция клинически значимых соматических мутаций зависит, с одной стороны, от количественной представленности в опухолях клеток, несущих детектируемую мутацию, а с другой  - от чувствительности используемой системы детекции. В силу этого существует необходимость использования высокочувствительных методических подходов для скрининга низких титров соматических мутаций при лечении онкологических заболеваний.

Цель данного исследования состояла в скрининге клинически значимых активирующих соматических мутаций в гене KRAS, титр которых находится за пределами детекции рутинных методов RT-PCR, путем использования высокочувствительного метода капельной цифровой ПЦР (ddPCR). Наличие/отсутствие мутаций в гене KRAS может служить предиктивным фактором прогнозирования лекарственной чувствительности/устойчивости клеток меланомы.

Материал и методы исследования

В данное исследование включены 10 биоптатов образцов доброкачественных неоплазий кожи и образцы меланомы кожи, полученные от 26 пациентов Юга России. Все образцы ДНК проходили первичный скрининг на предмет наличия/отсутствия BRAF-мутаций V600E с использованием набора реактивов «Real-time-PCR-BRAF-V600E» («Биолинк», Новосибирск), имеющего 5%-ный уровень чувствительности. По результатам тестирования образцы разделились на группу BRAF WT (не имеющие мутаций в гене BRAF) и группу образцов BRAF MT (имеющие мутации в гене BRAF). Все пациенты проходили плановое лечение в Клиническом онкологическом диспансере № 1 МЗ КК (г. Краснодара) и ДГКБ МЗ КК (г. Краснодар). ДНК для исследования была получена из FFPE-блоков с использованием набора реагентов ReliaPrep™ FFPE gDNA Miniprep System (Promega, USA). Предварительная оценка концентрации и амплификабельности препаратов ДНК проводилась методом RT-PCR с использованием набора реагентов «XY-Детект» («Синтол», Россия). Концентрация ДНК в образцах нормализовывалась до уровня, соответствующего уровню амплификабельности нативной ДНК, равному 2 нг/мкл.

Высокочувствительный скрининг наличия/отсутствия 7 активирующих соматических мутаций (G12A, G12C, G12D, G12R, G12S, G12V и G13D) во втором экзоне гена KRAS и мутаций V600 (V600E, V600K и V600R) в гене BRAF проводили методом Digital Droplet PCR (ddPCR) с использованием наборов ddPCR KRAS Screening Multiplex Kit (Bio-Rad, USA) и BRAF V600 Screening Kit (Bio-Rad, USA) соответственно. Исследование проведено с соблюдением всех принципов ICH GCP. Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета прикладных программ Microsoft Excel 2013 (Microsoft Corporation, США) и Statistica 10.0 (StatSoft Inc., США).

Результаты исследования и обсуждение

В образцах исследованных нами доброкачественных новообразований кожи с использованием метода ddPCR активирующие соматические мутации в генах BRAF и KRAS не обнаружены. Таким образом, полученные в данном разделе экспериментальные данные свидетельствуют о том, что в изученных нами образцах неоплазий кожи наличие активирующих соматических мутаций в генах BRAF и KRAS не является механизмом селективного отбора клонов клеток с повышенной пролиферативной активностью на стадии доброкачественного новообразования.

Результаты наших дальнейших экспериментов наглядно демонстрируют (рис. 1), что содержание активирующих соматических мутаций в гене KRAS в группах пациентов BRAF (MT) и BRAF (WT) существенно различается. В образцах биоптатов меланомы кожи BRAF (WT) медиана содержания копий ДНК с активирующими мутациями в гене KRAS в 6 раз превышает аналогичный показатель для группы пациентов BRAF (MT).

Рис. 1. Экспериментальные данные (медианы значений), полученные методом ddPCR, отражающие процентное содержание мутантного типа гена KRAS(MT) в биоптатах пациентов с меланомой кожи

При использовании теста Kruskall-Wallis доказаны статистически достоверные различия между медианами значений уровней соматических мутаций в гене KRAS для групп опухолевых биоптатов, BRAF(MT) и BRAF(WT) для p-value=2,1%. При использовании теста Манна-Уитни с коррекцией Bonferoni-Sidak доказано статистически достоверное различие между значениями средних арифметических для уровней соматических мутаций в гене KRAS для групп BRAF(MT) и BRAF(WT) для p-value=1,1%.

Нужно обратить внимание на то, что обнаруженные нами медианные уровни содержания активирующих мутаций в гене KRAS (0,04 и 0,24% соответственно для групп BRAF(MT) и BRAF(WT)) находятся значительно ниже уровня чувствительности детекции рутинных методов RT-qPCR (1-5%) и поэтому не могут быть обнаружены даже такими чувствительными тест-наборами, как «Therascreen® KRAS RGQ PCR Kit» (Qiagen). Полученные экспериментальные данные позволяют нам предположить, что опухолевые клетки меланомы кожи при малигнизации приобретающие активирующие соматические мутации в гене BRAF, с намного меньшей вероятностью подвержены клональной селекции клеток по признаку возникновения активирующих мутаций в гене KRAS. И наоборот, клетки меланомы кожи, не имеющие активирующих мутаций в гене BRAF, развиваются по другому пути активации сигнального пути EGFR→KRAS→BRAF: у этих клеток в процессе малигнизации с большей вероятностью отбираются клоны с наличием активирующих мутаций в гене KRAS. Это и обеспечивает им необходимый малигнизационный потенциал, даже при отсутствии активирующих мутаций в гене BRAF. Одновременный отбор клонов на наличие активирующих мутаций в генах KRAS и BRAF менее вероятен, но не исключен полностью: 40% образцов меланомы кожи, вошедших в данное исследование, содержали активирующие соматические мутации в генах KRAS и BRAF одновременно.

Рис. 2. Количественное распределение титра мутантных типов гена KRAS (в процентах от общего) в группах BRAF(WT) и BRAF(MT). Содержание активирующих мутаций на уровне менее 0,1%, в диапазоне от 0,1 до 2% и более 2%. По оси ординат – частота встречаемости данной группы событий среди всех образцов

На рисунке 2 представлены экспериментальные данные, демонстрирующие распределение пациентов на группы с различной количественной представленностью (%) активирующих соматических мутаций в гене KRAS. Так, например, 60% образцов меланомы кожи группы BRAF(MT) имеют титр активирующих мутаций в гене KRAS, не превышающий уровня 0,1% от всех регистрируемых событий, а 40% образцов меланомы кожи группы BRAF(WT) имели титр мутаций в гене KRAS в диапазоне от 0,1 до 2%, и ни один образец (0%) не содержал титра мутаций в гене KRAS, превышающего 2% от всех регистрируемых событий. Это свидетельствует о том, что в образцах меланомы кожи группы BRAF(MT) возникновение активирующих соматических мутаций в гене KRAS менее вероятно в силу того, что клональная селекция клеток при малигнизации преимущественно пошла по другому механизму: отбор клонов с наличием активирующих мутаций в гене BRAF.

При отсутствии активирующих соматических мутаций в гене BRAF в исследованных образцах меланомы кожи (рис. 2) количественное распределение мутаций в гене KRAS носило диаметрально противоположный характер: 75% всех зарегистрированных мутационных событий в гене KRAS находились в количественном диапазоне от 0,1 до 2% и 6% от всех зарегистрированных событий - в диапазоне более 2%. Эти данные подтверждают наше предположение о том, что в клетках меланомы кожи с наличием активирующих мутаций в гене BRAF активирующие мутации в гене KRAS возникают не только с меньшей вероятностью, но и в значительно меньших количествах.

Избирательное ингибирование BRAF является стандартным терапевтическим подходом при лечении прогрессирующей меланомы кожи у пациентов с наличием активирующих соматических мутаций в гене BRAF. Тем не менее только приблизительно 50% пациентов с меланомой кожи имеют активирующие мутации в гене BRAF, детектируемые рутинными методами. Увеличение выживаемости без прогрессирования этого заболевания и общей выживаемости после применения ингибиторов BRAF является весьма скромным [10]. Поэтому было предложено несколько механизмов устойчивости к ингибиторам BRAF [11]. Одним из прогнозов устойчивости к ингибиторам BRAF является то, что механизмы усиления димеризации RAF (aRAF, bRAF и cRAF) приводят к возникновению лекарственной устойчивости. К ним относятся изменения, которые повышают активность белков RAS, поскольку канонический механизм димеризации и активации RAF зависит от RAS. Изоформы RAS играют значительную роль в генезе онкологических заболеваний человека, а новые технологии привели к разработке перспективных способов ингибирования передачи сигналов RAS [12-14].

В нашем исследовании мы наглядно продемонстрировали, что в клетках меланомы кожи пациентов Юга России наряду с активирующими мутациями V600 в гене BRAF с частотой от 40 до 80% детектируются активирующие мутации в гене KRAS, которые не могут быть зарегистрированы рутинными методами RT-PCR с чувствительностью 5%. Наличие низкого титра клонов клеток с активирующими мутациями в гене KRAS может служить резервным механизмом быстрого возникновения лекарственной устойчивости клеток меланомы кожи к таргетной терапии. Поэтому использование ингибиторов KRAS в сочетании с ингибированием BRAF может быть эффективным клиническим подходом, в том числе предиктивным, с целью блокирования приобретения лекарственной устойчивости клетками меланомы. Приобретенная устойчивость к ингибиторам BRAF в клетках меланомы кожи зависит от динамической регуляции экспрессии и наличия активирующих мутаций в гене KRAS (а также в других генах семейства RAS). Гены RAS вызывают последующую активацию AKT (серин/треонин-специфичных протеин киназ). Этот негативный эффект имеющейся или приобретенной лекарственной устойчивости может быть преодолен с помощью ингибиторов KRAS и поэтому является дополнительной стратегией при лечении меланомы кожи [15].

Выводы

Результаты нашего исследования наглядно демонстрируют, что от 40 (группа пациентов с BRAF MT) до 80% (группа пациентов с BRAF WT) образцов меланомы кожи пациентов Юга России содержали активирующие соматические мутации в гене KRAS, которые не могли быть детектированы рутинными методами RT-PCR с чувствительностью на уровне 5%. Наличие активирующих мутаций в гене KRAS (генах RAS) канонически способствует димеризационной активации RAF-компонентов сигнального пути. Это является одним из механизмов малигнизации клеток кожи и возникновения у них резервных механизмов приобретения и проявления лекарственной устойчивости. Причиной этого является внутриопухолевая клеточная гетерогенность, проявляющаяся в присутствии минорных опухолевых клеточных клонов, изначально устойчивых к лекарственной терапии, применяемой к основной опухолевой массе. В условиях применения таргетных и/или химиопрепаратов эти клоны могут получать селективное преимущество, обеспечивая лекарственную устойчивость и прогрессию роста опухоли. Следовательно, для повышения подбора эффективных таргетных препаратов и преодоления быстрого приобретения лекарственной устойчивости клетками меланомы кожи необходим множественный скрининг активирующих мутаций в целевых генах на уровне чувствительности детекции не менее чем 0,5%.