Scientific journal

Modern problems of science and education

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

Сахарный диабет 1-го типа (СД 1) – метаболическое (обменное) заболевание, характеризующееся гипергликемией, в основе которого лежит деструкция β-клеток, приводящая к абсолютному дефициту инсулина.

Сахарный диабет представляет собой важнейшую медико-социальную проблему во всем мире. Это объясняется его широким распространением, тяжестью поздних осложнений, дороговизной средств диагностики и лечения, которые необходимы больным в течение всей жизни. По данным Росстата на сегодняшний день в мире насчитывается более 400 млн человек, больных СД, и распространенность заболевания продолжает неуклонно расти. На начало 2017 г. общая численность пациентов, страдающих СД, в РФ составила 4,348 млн человек, из них: 4 млн – СД 2-го типа, 255 тыс. – СД 1-го типа и 75 тыс. – СД других типов. По последним данным в Республике Саха (Якутия) с диагнозом СД проживают 21 677 человек, из них: 20 508 – это пациенты с СД 2-го типа, 1099 – больные СД 1-го типа, 70 человек страдают СД других типов [1].

Согласно современным данным в развитии СД 1-го типа принимают участие большое число генов [2], более половины генетических рисков обусловлено участием полиморфных вариантов генов HLA, расположенных на коротком плече хромосомы 6 (6p21). Полагая, что вклад генетических факторов в риск развития СД 1-го типа составляет более 50%, полный вклад полиморфных аллелей локуса HLA может быть оценен более чем 25%.

Определение аллелей HLA помогает в определении риска развития СД 1-го типа. Это особенно полезно в профилактике у пациентов с высокой степенью риска [3]. HLA-типирование также требуется в генетических исследованиях, направленных на определение молекулярной основы СД 1-го типа [4]. Тем не менее высокая стоимость HLA генотипирования является одной из основных проблем, препятствующих проведению масштабных исследований. В связи с этим ведутся исследования по определению HLA аллелей с использованием однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) (Walsh E.C. et al., 2003; Leslie S. et al., 2008; Dilthey A.T. et al., 2011; Ferreira R.C. et al., 2012; Barker J.M. etal. 2008; Cao Ngueyen et al., 2013).

В России исследования по определению HLA-аллелей с использованием однонуклеотидных полиморфизмов не проводятся. В связи с этим на сегодняшний день существует необходимость в проведении исследований, направленных на разработку регионально-адаптированного метода HLA-типирования СД 1-го типа с помощью однонуклеотидных полиморфизмов (SNP).

Целью данного исследования являлось выявление ассоциации полиморфных вариантов генов HLA II класса с СД 1-го типа среди якутской популяции.

Материалы и методы исследования

Экспериментальная часть работ по генотипированию полиморфизмов rs3104413, rs2854275, rs9273363 была проведена в лаборатории наследственной патологии отдела молекулярной генетики Якутского научного центра комплексных медицинских проблем (ЯНЦ КМП). Для исследования использованы образцы ДНК из коллекции биоматериала ЯНЦ КМП с применением УНУ «Геном Якутии» (рег. № USU_507512). Выборка состояла из 92 пациентов больницы ФГБНУ «Якутский научный центр комплексных медицинских проблем», ГАУ РС(Я) РБ № 1 НЦМ Педиатрический центр и эндокринологического отделения ГБУ РС (Я) «Якутская городская клиническая больница» г. Якутска. В состав выборки вошли 92 пациента с диагнозом СД 1-го типа в возрасте от 4 лет до 56 лет, проживающих в РС (Я), якутов по этнической принадлежности. По половому признаку пациенты разделились на 44 мужчин (47,8%) и 48 женщин (52,2%). Средний возраст пациентов составил 23,04±0,27 года (от 4 до 56 лет), средний возраст пациентов мужского пола – 20,5±2,3 года (от 5 до 40 лет), женского пола – 25,11±2,59 года (от 4 до 56 лет). Популяционную выборку составили 210 якутов, не страдающих СД 1-го типа. Этническая принадлежность учитывалась до третьего поколения.

Амплификация области гена HLA-DQA1, содержащего однонуклеотидный полиморфизм rs3104413, осуществлялась в процессе ПЦР в реальном времени с использованием пар праймеров и аллельспецифичных зондов для амплификации ДНК, описанных в журнале «NATURE COMMUNICATIONS» (Isabelle Serr et al., 2015). Праймеры и зонды синтезированы компанией ООО «Биотех-Индустрия (Lumiprobe)» (Москва, Россия). Последовательность праймеров: Форвард праймер 5'-CAGCTGAGCACTGAGTAG-3', реверс праймер 5'-GCAGTTGAGAAGTGAGAG-3'. Структура зондов: FAM – Probe rs3104413 LPC [6FAM]CAGCCT[+G]CT[+C]TC[+C]TA[+T]TGG[BHQ1], HEX – Probe rs3104413 LPG [HEX]CAGCCT[+G]CT[+G]TC[+C]TA[+T]TGG[BHQ1].

Амплификация проводилась согласно температурной программе, приведенной ниже (табл. 1).

Таблица 1

Температурная программа амплификации полиморфизма rs3104413

Измерение сигнала флуоресценции проводилось на втором этапе реакции (55°С – 1:00). Детекция флуоресценции осуществлялась «по конечной точке» согласно протоколу прибора «Real-time CFX 96 Touch» («Biorad», США). Пример распределения облаков генотипов проведения ПЦР и детекции флуоресценции «по конечной точке» представлен на рисунке 1. Соответствие флуоресцентных красителей: аллель C – канал FAM, аллель G – канал HEX.

Рис. 1. Распределение облаков генотипов полиморфизма rs3104413 гена HLA-DQA1. Примечание: «К–» – отрицательный контроль, C/C – гомозигота по предковому аллелю C. C/G – гетерозигота, G/G – гомозигота по мутантному аллелю G

Анализ однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) rs2854275, rs9273363 проводился с помощью аллельспецифичных праймеров (АС-ПЦР). Праймеры были синтезированы компанией ООО «Сибэнзим» (г. Новосибирск, Россия). В рамках настоящей работы были созданы оригинальные аллельспецифичные праймеры на основе референсного генома hg38/Human по базе UCSC Genome Browser (http://genome.ucsc.edu/index.html). Последовательность праймеров и условия ПЦР представлены в таблице 2.

Таблица 2

Последовательность праймеров и условия АС-ПЦР*

Примечание. * – АС-ПЦР – аллель-специфическая ПЦР, ** – п.о. – пара оснований. *** – Dominquez O et al., 1992; Michelle A.M. et al., 2000; Steffens Nakken et al., 1995

Результаты амплификации и рестрикции фракционировали в 3–4%-ном агарозном геле с бромистым этидием при напряжении 120–300 Вт в течение 30–45 мин. Анализ результатов электрофореза проводили под UV-лучами в гель-документирующем приборе Vilbеr Lourmat (рис. 2, 3).

Рис. 2. Электрофореграмма продукта амплификации rs2854275 в 2%-ном агарозном геле Примечание: п.н. – пар нуклеотидов. М – ДНК маркер pUC19/MspI. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 – нумерация образцов. 270 п.н. – внутренний контроль. 192 п.н. – аллель T, 134 п.н. – аллель G

Рис. 3. Электрофореграмма продукта амплификации rs9273363 в 2%-ном агарозном геле Примечание: п.н. – пар нуклеотидов. М – ДНК маркер pUC19/MspI. 1, 2, 3, 4, 5 – нумерация образцов. 270 п.н. – внутренний контроль. 141 п.н. – аллель A, 146 п.н. – аллель C

Статистический анализ полученных результатов медико-генетического исследования был проведен с помощью программы: «Office Microsoft Excel 2010», «Statistica 8.0». Частоты аллелей и генотипов rs3104413, rs2854275 и rs9273363 определяли путем прямого подсчета. Результаты считались значимыми, когда значение «р» было меньше 0,05 (p<0,05).

Результаты исследования и их обсуждение

В результате проведенного анализа установлено, что только для полиморфного варианта rs2854275 в популяции якутов наблюдаемое распределение генотипов соответствовало ожидаемому при равновесии Харди–Вайнберга (РХВ). Отклонение установлено для полиморфного варианта rs3104413 (Х²=65,966, р<0,001), которое характеризовалось уменьшением уровня наблюдаемой гетерозиготности (Но=0,219) по сравнению с ее ожидаемым уровнем (Не=0,498). Для полиморфного варианта rs9273363 (Х² = 134, р<0,001), которое характеризовалось уменьшением уровня наблюдаемой гетерозиготности (Но=0,0) по сравнению с ее ожидаемым уровнем (Не=0,029) (табл. 3).

Таблица 3

Распределение генотипов и аллелей полиморфизмов rs3104413, rs2854275, rs9273363 в популяционной выборке якутов

Примечание: n – численность выборки, Ho, He – наблюдаемая и ожидаемая гетерозиготность, Х2 по Харди–Вайнбергу, р – уровень достоверности

Согласно базе данных проекта «1000 геномов» для полиморфизма rs3104413 во всех исследованных выборках популяций мира установлены высокая частота мутантного аллеля С (78–92%) и низкая частота предкового аллеля G (8–22%) [5]. В исследованной выборке якутов частота предкового аллеля G была выше и составила 52,9%, тогда как частота мутантного аллеля С характеризовалась более низкими значениями и составила 47,1%, что может быть следствием как недостаточного объема выборки, так и этнической особенности.

Для полиморфизма rs2854275 в исследованной выборке якутов частота предкового аллеля G (92,1%) преобладала над частотой мутантного аллеля Т (7,9%), что сопоставимо с результатами ранее проведенных исследований, в которых отмечаются высокая частота предкового аллеля G (90–97%) и низкая частота мутантного аллеля Т (3–10%) [5].

Полиморфизм rs9273363 у якутов характеризовался преобладанием частоты предкового аллеля С (98,5%) по сравнению с частотой мутантного аллеля А (1,5%), что согласуется с результатами ранее проведенных исследований, в которых отмечаются высокая частота предкового аллеля С (67–91%) и низкая частота мутантного аллеля А (9–33%) [5].

Результаты анализа распределения частот аллелей и генотипов полиморфизмов rs3104413, rs2854275 и rs9273363 среди больных СД 1-го типа и контрольной выборки представлены в таблице 4.

Таблица 4

Частота встречаемости генотипов и аллелей полиморфизмов rs3104413, rs2854275 и rs9273363 в группе больных СД 1-го типа и контрольной выборки

Примечание. Достигнутый уровень значимости при сравнении распределения генотипов (*) и частоты аллелей (**) в группах сравнения 1 и 2. n – численность выборок, Х2 с поправкой Йейтса.

Анализ распределения генотипов показал, что наиболее распространенным генотипом по полиморфизму rs3104413 в группе больных СД 1-го типа является С/С (69,6%), тогда как в контрольной группе чаще встречался гомозиготный вариант G/G (41,1%). В ходе исследования установлено, что преобладающим аллелем полиморфизма rs3104413 в популяции якутов является аллель G (52,9%), при том что в ранее исследованных выборках популяций мира установлено преобладание частоты мутантного аллеля С (78–92%) [5]. Таким образом, мутантный аллель С для якутов может использоваться в качестве маркера повышенного риска развития СД 1 (OR – 4,036; 95% CI: 2,71–6,02; р<0,001).

Выявлено, что самым распространенным генотипом полиморфного варианта rs2854275 в группе контроля является гомозиготный генотип G/G (88,5%), а в группе больных СД 1-го типа – генотип G/Т (56,3%). Анализ отношения шансов показал, что частота встречаемости аллеля Т в группе людей с СД 1-го типа статистически достоверно выше (44,8%), чем среди людей, не страдающих сахарным диабетом 1-го типа (5,7%), что позволяет считать носительство аллеля Т предрасполагающим фактором к развитию СД 1-го типа (OR= 13,8; 95% CI: 7,48–25,46; р<0,001).

Полиморфный вариант rs9273363 характеризовался достоверно низкой частотой аллеля А (1,5%) в группе здоровых индивидов по сравнению с группой больных СД 1-го типа (53,6%). Отношение шансов (OR) риска развития заболевания для носителей аллеля А составило 76,15 (95% CI:24,89–233,02; р<0,001).

Результаты анализа распределения частот генотипов rs3104413 в сочетании с генотипами полиморфизмов rs2854275, rs9273363 среди больных СД 1-го типа и контрольной выборки представлены в таблице 5.

Таблица 5

Частота встречаемости генотипов полиморфизмов rs3104413, rs2854275, rs9273363 среди больных СД 1-го типа и контрольной выборки

Всего выявлено 11 вариантов сочетаний генотипов полиморфизмов rs3104413, rs2854275, rs9273363. В группе больных с СД 1-го типа наиболее часто встречались варианты № 3, 1 и 4, тогда как в группе контроля чаще отмечались № 5, 2 и 8.

Заключение

Наиболее высокими показателями относительного риска среди сочетаний генотипов являлись С/С полиморфизма rs3104413 в сочетании с гетерозиготным генотипом G/T полиморфизма rs2854275 – RR = 4,234 (р<0,001); генотип С/С полиморфизма rs3104413 в сочетании с генотипом Т/Т полиморфизма rs2854275 – RR = 3,692 (р<0,001); генотип G/G полиморфизма rs3104413 в сочетании с генотипом А/С полиморфизма rs9273363 – RR = 3,625 (р<0,001).

Таким образом, полученные данные могут быть использованы в качестве биологических предикторов развития СД 1-го типа с целью проведения своевременных персонализированных профилактических мероприятий.

Исследование было проведено в рамках НИР Изучение генетической структуры и груза наследственной патологии популяций Республики Саха (Якутия).