Мы живем в стареющем обществе. В современной медицине важное место занимает лечение лиц престарелого возраста. Нарушения работы иммунной системы считаются одной из основных причин старения. В динамике старения возможно нарушение работы как иммунной системы в целом, так и отдельных ее компонентов и механизмов. Их выявление представляется особенно важным при использовании дополнительных экзогенных антигенных воздействий, к которым относится введение ботулотоксина типа А для коррекции гипермимических морщин [1]. Следует учитывать, что это может оказывать влияние и на качество жизни людей зрелого возраста [2].
Взаимосвязь различных патологических процессов с нарушениями иммунологической реактивности позволила сделать вывод, что старение иммунной системы уменьшает продолжительность жизни [3]. При этом ослабление функциональной активности иммунитета с возрастом может быть обусловлено как изменениями самих иммунокомпетентных клеток, так и изменениями клеточного окружения, нейрогормонального равновесия [4].
Согласно результатам проведенного иммунологического обследования [5] было выявлено, что в возрасте от 60 до 74 лет происходит резкое снижение защитных возможностей врожденного иммунитета.
Изменения реактивности неспецифического клеточного и антигенспецифического иммунного ответа у пожилых пациентов носят разнонаправленный характер. Наиболее показательными данными, подтверждающими данный аргумент, являются: снижение СD 3+, CD4+ T-лимфоцитов; как снижение, так и повышение общей гемолитической активности комплемента; уменьшение метаболической активности клеточных факторов неспецифической резистентности, а кроме того, увеличение СРБ [6].
Цель исследования: проанализировать изменение клеточных показателей иммунного статуса в зависимости от возраста пациенток и оценить возможное влияние на них ботулотоксина типа А (БТА), применяемого для коррекции гипермимических морщин.
Материал и методы исследования. При выполнении работы было проведено клинико-лабораторное обследование 200 пациенток разного возраста, обратившихся для коррекции возрастных изменений кожи лица в клиническую базу ФГБОУ ВО ТГМУ Минздрава России ООО «Профессорская клиника Юцковских» с 2011 по 2015 годы. Исследование проведено в два этапа. На I этапе ретроспективно была проведена оценка 300 амбулаторных карт пациенток, получавших коррекцию гипермимических морщин препаратом ботулотоксина типа А. Оценены клиническая эффективность (по времени наступления эффекта и удовлетворенности пациентки), наличие и характер побочных эффектов. На II этапе – наблюдательном, сравнительном, проспективном – было обследовано 200 пациенток трех возрастных групп, которые были разделены на 2 равные группы: в первой группе женщины (n=100 человек) получали лечение гипермимических морщин препаратом ботулотоксина типа А в дозе от 100 до 150 ед. Во второй группе – группе сравнения – эта терапия не проводилась. В качестве материала для иммунологических исследований применялась цельная кровь. Проведены иммунофенотипирование основных иммунокомпетентных клеток с анализом основных эффекторных клеток – Т-лимфоцитов (CD3+CD19-), В-лимфоцитов (CD19+CD3-), NK-клеток (CD3-CD16+CD56+), оценка основных субпопуляций Т-лимфоцитов (CD4+CD3+, CD 19-, CD8+) и маркеров позитивной (CD25+, HLA-DR+) и негативной (CD95+) активации иммунокомпетентных клеток и Т-лимфоцитов (CD3+ CD25+, CD3+HLA-DR+, CD3+CD95+), исследована также минорная популяция лимфоцитов, относящихся к нормальным Т-клеткам-киллерам (CD3+CD16+ CD56+) в трех возрастных группах: молодого, среднего и пожилого возраста, распределенных в зависимости от способа коррекции гипермимических морщин: с применением ботулотоксина типа А или нет. Иммунофенотипирование лимфоцитов проводили методом проточной цитометрии (цитофлуориметр FACScan, Becton Dickinson) с использованием моноклональных антител к кластерам дифференцировки (Claster of Differentiation – CD) с двойной меткой (Bekman Coulter, Франция), рассчитывая удельный вес клеток (%) и их абсолютное содержание в единице объема крови. Математическая обработка показателей проведена методами описательной вариационной статистики с использованием программ «Statistica-10», «R» и «SPSS® v.16.», «MedCalc». Для определения направления и формы связи между признаками, измерения ее степени и оценки статистической значимости использовали методы корреляционного анализа: коэффициент ранговой корреляции Спирмена, критерий χ2.
Результаты исследования и обсуждение. Анализ результатов иммунофенотипирования основных иммунокомпетентных клеток показал, что у женщин пожилого возраста снижен удельный вес лимфоцитов по сравнению с пациентками молодого возраста (р<0,05, табл. 1), однако их абсолютное количество отличалось незначительно (р>0,05). При анализе экспрессии основных дифференцировочных маркеров лимфоцитов и их субпопуляций выявлено, что у женщин пожилого возраста статистически достоверно снижен удельный вес Т-лимфоцитов (CD3+CD19-) за счет уменьшения доли CD3+CD4+Т-клеток хелперов.
Таблица 1
Характеристика основных популяций лимфоцитов у обследованных пациенток основной и контрольной групп в зависимости возраста
|
Показатели M±m |
Единица измерения |
Основная группа (I) |
Группа сравнения (II) |
||||
|
30–44 года n=36 |
45–59 лет n=38 |
60–74 года n=26 |
30–44 года n=30 |
45–59 лет n=40 |
60–74 года n=30 |
||
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
||
|
Лимфоциты |
% |
36,3±1,8 |
32,4±1,3 |
29,6±2,8 р1-3<0,05 |
36,0±1,6 р3-4<0,05 |
33,2±1,4 |
30,1±2,1 р1-6<0,05 р4-6<0,01 |
|
кл/109/л |
2,0±0,24 |
2,1±0,33 |
1,80±0,3 |
2,1±0,2 |
2,15±0,24 |
1,84±0,16 |
|
|
CD3+ CD19-
|
% |
70,5±1,6 |
69,4±2,0 р2-6<0,05 |
60,3±3,2↓ р1-3<0,01 р2-3<0,05 |
71,4±2,0 р3-4<0,01 |
68,7±1,7 р5-6<0,05 р3-5<0,05 |
61,3±2,8 р1-6<0,01 р4-6<0,01 |
|
кл/109/л |
1,41±0,16 |
1,38±0,12 |
1,18±0,21 |
1,48±0,17 |
1,47±0,24 |
1,18±0,25 |
|
|
CD19- CD3+ CD4+ |
% |
43,4±2,1 |
42,8±1,7 р2-6<0,05 |
36,6±2,3↓ р1-3<0,05 р2-3<0,05 |
42,7±2,0 р3-4<0,05 |
43,4±2,16 р5-6<0,01 |
37,0±2,1 р1-6<0,01 р4-6<0,05 |
|
кл/109/л |
0,87±0,16 |
0,90±0,14 |
0,70±0,15 |
0,88±0,17 |
0,93±0,15 |
0,71±0,16 |
|
|
ИРИ: CD3+ CD4+ /CD3+ CD8+ |
1,60±0,13 |
1,57±0,11 |
1,30±0,15 |
1,54±0,12 |
1,61±0,13 |
1,32±0,12 |
|
|
CD3- CD19+ |
% |
12,6±0,8 |
12,9±1,4 р2-6<0,05 |
18,4±2,0↑ р1-3<0,05 р2-3<0,05 |
13,0±1,2 р3-4<0,05 р4-6<0,01 |
14,1±1,4 |
18,6±1,9 |
|
кл/109/л |
0,25±0,07 |
0,27±0,05 |
0,22±0,04 |
0,27±0,03 |
0,30±0,04 |
0,34±0,05 |
|
|
CD3+ CD16+ CD56+ |
% |
2,5±0,4 |
3,6±0,3 р2-3<0,01 |
6,4±0,3↑ р1-3<0,01 |
2,8±0,3 р3-4<0,001 р4-6<0,01 |
3,2±0,4 р3-5<0,05 р5-6<0,01 |
6,0±0,2 р1-6<0,01 р2-6<0,05 |
|
кл/109/л |
0,05±0,01 |
0,07±0,02 |
0,12±0,02 р1-3<0,05 |
0,06±0,01 р3-4<0,05 |
0,07±0,01 |
0,11±0,02 р1-6<0,05 р4-6<0,05 |
|
|
CD25+ |
% |
8,7±0,7 |
9,4±0,6 |
11,3±0,8 р1-3<0,05 р3-4<0,01 |
7,9±0,5 р4-6<0,01 |
8,1±0,7 |
11,0±0,9 р1-6<0,05
|
|
кл/109/л |
0,17±0,05 |
0,19±0,04 |
0,19±0,03 |
0,17±0,03 |
0,17±0,04 |
0,2±0,04 |
|
|
CD3+ CD25+ |
% |
5,2±0,4 |
4,9±0,6 |
8,6±0,7 р1-3<0,05 р2-3<0,05 |
5,1±0,7 р3-4<0,05 |
5,0±0,6 р3-5<0,05 |
9,1±0,6 р1-6<0,001 р2-6<0,01 р5-6<0,01 |
|
кл/109/л |
0,10±0,03 |
0,10±0,02
|
0,15±0,01 р2-3<0,05 |
0,11±0,03
|
0,10±0,02
|
0,16±0,03 р2-6<0,05 р5-6<0,05 |
|
|
CD3+CD95+ |
% |
7,3±0,8 |
6,5±0,7 |
10,47±0,4↑ р2-3<0,001 р1-3<0,001 |
6,3±0,5 р3-4<0,001 |
7,0±0,8 р3-5<0,05 |
9,6±0,6 р4-6<0,01 р5-6<0,05 |
|
кл/109/л |
0,14±0,04 |
0,14±0,03 |
0,18±0,02 |
0,13±0,02 |
0,15±0,03 |
0,17±0,03 |
|
|
HLA-DR+ |
% |
14,6±1,5 р1-6<0,01 |
15,2±1,0 р2-6<0,001 р2-3<0,001 |
7,5±0,8↓ р1-3<0,001 |
13,5±1,6 р3-4<0,05 |
16,0±1,4 р5-3<0,001 |
8,1±0,9↓ р5-6<0,01 р4-6<0,05 |
|
кл/109/л |
0,29±0,04 р1-6<0,01 |
0,32±0,07 р2-3<0,05 р2-6<0,05 |
0,15±0,03 р1-3<0,01 |
0,28±0,04 р3-4<0,05 |
0,33±0,05 р5-3<0,01 |
0,15±0,02 р5-6<0,01 р4-6<0,05 |
|
|
CD3+HLA-DR+ |
% |
4,8±0,5 |
4,4±0,6 р2-3<0,05 р2-6<0,05 |
1,6±02↓ р1-3<0,001 |
3,9±0,4 р3-4<0,05 |
4,7±0,7 р5-3<0,001 |
2,0±0,3↓ р5-6<0,01 р4-6<0,05 |
|
кл/109/л |
0,096±0,02 |
0,09±0,02 р2-3<0,05 |
0,03±0,01 р1-3<0,05 |
0,085±0,02 р3-4<0,05 |
0,10±0,02 р5-3<0,01 |
0,04±0,01 р5-6<0,01 р4-6<0,05 |
|
Примечание: статистическая достоверность различий между исследуемыми группами: р 1,2,3,4,5,6.
Молекула CD3+ – это главный маркер зрелых Т-клеток, она состоит из трех полипептидных цепей – γ, δ и ε. Молекула CD3 – это часть Т-клеточного рецептора (ТСR), распознающего антиген. Молекула CD4 является корецептороной структурой ТСR, экспрессируется на Т-хелперах и участвует в распознавании антигена совместно со структурами МНС II. При этом их снижение определено в обеих включенных в исследование группах женщин пожилого возраста (р<0,05–0,01).
Для реализации антигенспецифической цитотоксичности в организме дифференцирована субпопуляция Т-клеток-киллеров или цитотоксических Т-лимфоцитов (CD3+CD8+CD19-). Ключевая роль этих клеток – это защита от видоизмененных и инфицированных собственных клеток. Не установлено существенных различий удельного веса и абсолютного количества CD8+ Т-цитотоксических лимфоцитов в зависимости от возраста (табл. 1). Можно согласиться с авторами, которые считают, что при старении развивается иммунодефицит по Т-системе с преимущественным снижением Т-хелперов [7]. Однако нами не выявлено статистически значимого нарушения иммунорегуляторного индекса у пациенток пожилого возраста, следует только отметить тенденцию к его уменьшению в III возрастной группе (р<0,1). Это в целом отражает удовлетворительную количественную характеристику Т-клеточного иммунного ответа у женщин, в том числе пожилого возраста.
Нами не установлено существенных возрастных изменений CD3-CD19+ В-лимфоцитов у женщин молодого и среднего возраста (табл. 1). Это согласуется с мнением большинства исследователей [1]. Но в группе женщин пожилого возраста определено статистически значимое увеличение удельного веса В-клеток, тогда как их абсолютное содержание не отличалось в других исследованных группах (табл. 1).
При оценке содержания CD3- CD16+ CD56+ (NК-клеток) не было выявлено существенных различий их удельного веса и абсолютного количества в анализируемых группах (табл. 1). В то же время зарегистрировано статистически значимое (р<0,05–0,01) увеличение у женщин пожилого возраста минорной популяции лимфоцитов, одновременно экспрессирующих рецепторы Т-лимфоцитов (CD3+) и CD16+ CD56+-структуры натуральных киллеров и относящихся к клеткам натуральным Т-клеткам-киллерам (табл. 1). Учитывая функциональную роль этих клеток, считаем, что их накопление в крови у людей старше 60 лет имеет адаптивную роль в обеспечении противоопухолевого иммунного ответа в первую очередь.
Анализ экспрессии активационных молекул на иммунокомпетентных клетках и Т-лимфоцитах позволил выявить ряд закономерностей: у женщин пожилого возраста обеих сравниваемых групп выявлено увеличение доли иммунокомпетентных клеток, экспрессирующих CD25 – маркер их ранней активации (табл. 1). При этом возрастало абсолютное число Т-лимфоцитов, несущих рецептор к ИЛ-2 (CD3+ CD25+). Так как этот маркер характерен и для Т-регуляторных клеток, нельзя отрицать вероятность увеличения у пожилых людей числа естественных супрессорных клеток (Т-регуляторных лимфоцитов), в то время как экспрессия маркера поздней позитивной активации была снижена как на всех иммуноцитах, так и на зрелых Т-лимфоцитах у пациенток пожилого возраста. Это свидетельствует о нарушении процессов переключения активации клеток с ранней на позднюю, что может явиться причиной их функционального дефекта.
Оценка доли числа клеток, экспрессирующих CD95 рецептор (маркер готовности к апоптозу), позволила выявить нарушения только в группе женщин пожилого возраста (табл. 1). Они касались доли зрелых Т-лимфоцитов (CD3+CD95+) с маркером поздней негативной активации. Полученные результаты позволяют объяснить механизм выявленного дефицита CD3+CD4+ – Т-хелперов, которые значительно более чувствительны к апоптозу, у этой категории обследованных. Корреляционный анализ позволил выявить сильную прямую связь между содержанием CD4 и CD25 антигенов на CD3+-лимфоцитах (r=0,72; р<0,05) и обратную среднюю связь между содержанием HLA-DR+ на CD3+-клетках (r=0,5; р<0,05), что подтверждает дефект процессов активации Т-клеточного иммунитета в пожилом возрасте.
Итак, при анализе показателей, характеризующих структуру основных популяций и субпопуляций лимфоцитов периферической крови пациенток в зависимости от возраста, у пациенток старше 60 лет выявлено снижение общего числа Т-лимфоцитов, которое обусловлено дефицитом CD3+CD4+ Т-клеток-хелперов. При этом установлены признаки хронической Т-клеточной активации с нарушением переключения этих процессов с ранней на позднюю и усилии экспрессии маркера готовности к апоптозу (CD3+CD95+) у этой категории пациенток.
Результаты иммунофенотипирования основных лимфоцитов и экспрессии на них активационных маркеров у женщин разных возрастных групп, получавших коррекцию гипермимических морщин, через неделю и через 28 дней после инъекции БТА представлены в таблице 2. Проведенный анализ не позволил выявить статистически значимого влияния инъекций БТА на показатели иммунного статуса. В группе женщин пожилого возраста как до введения БТА, так и в динамике после его введения определено снижение удельного веса лимфоцитов, СД3+СД19-, СД3+СД4+СД19-, увеличение СД3+СД16+СД56+, а также сохранялось нарушение процессов активации иммунокомпетентных клеток (табл. 2).
Таблица 2
Результаты иммунофенотипирования лимфоцитов крови у пациенток, получавших ботулотоксин типа А для коррекции гипермимических морщин, в динамике
|
Возраст |
30–44 года, n=36 |
45–59 лет, n=38 |
60–74 года, n=26 |
||||
|
Показатели M±m |
7-е сутки |
28-е сутки |
7-е сутки |
28-е сутки |
7-е сутки |
28-е сутки |
|
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
||
|
Лимфоциты, % |
37,0±1,6 р1-5<0,05 р1-6<0,001 |
34,5±1,2 р2-5<0,05 р2-6<0,05 |
36,6±1,8 р3-5<0,05 р3-6<0,01 |
35,8±0,8 р4-5<0,001 р4-6<0,001 |
30,5±1,4↓ |
31,2±0,8↓ |
|
|
Лимфоциты (х10/9л) |
2,1±0,15 |
2,0±0,2 |
2,0±0,15 |
2,2±0,17 |
1,9±0,2 |
1,8±0,17 |
|
|
CD3+ CD19-
|
% |
70,9±1,3 р1-5<0,01 р1-6<0,001 |
71,8±2,0 р2-5<0,001 р2-6<0,001 |
72,0±1,7 р3-5<0,001 р3-6<0,01 |
69,6±1,4 р4-5<0,01 р4-6<0,01 |
62,1±1,6↓ |
60,4±2,1↓ |
|
кл/109/л |
1,50±0,15 |
1,45±0,2 |
1,44±0,15 |
1,53±0,16 |
1,20±0,21 |
1,14±0,12 |
|
|
CD19- CD3+ CD4+ |
% |
43,4±2,1 р1-5<0,05 р1-6<0,05 |
42,8±1,4 р2-5<0,01 р2-6<0,001 |
44,0±1,9 р3-5<0,01 р3-6<0,05 |
43,2±1,6 р4-5<0,05 р4-6<0,05 |
38,0±0,8↓ |
37,1±1,6↓ |
|
кл/109/л |
0,86±0,12 |
0,83±0,16 |
0,84±0,13 |
0,87±0,18 |
0,87±0,15 |
0,74±0,21 |
|
|
ИРИ: CD3+ CD4+ /CD3+ CD8+ |
1,61±0,13 |
1,57±0,12 |
1,60±0,11 |
1,55±0,09 |
1,31±0,12 |
1,30±0,12 |
|
|
CD3- CD19+ |
% |
13,4±1,3 р1-5<0,05 р1-6<0,05 |
13,1±1,4 р2-5<0,05 р2-6<0,05 |
13,8±1,5 р3-5<0,05 р3-6<0,05 |
14,0±1,4 р4-5<0,05 р4-6<0,05 |
17,8±1,3↑ |
18,6±1,8↑ |
|
кл/109/л |
0,26±0,08 |
0,25±0,09 |
0,27±0,12 |
0,24±0,1 |
0,30±0,07 |
0,31±0,1 |
|
|
CD3+ CD16+ CD56+ |
% |
2,8±0,3 р1-5<0,001 р1-6<0,001 |
2,4±0,2 р2-5<0,001 р2-6<0,001 |
2,9±0,3 р3-5<0,01 р3-6<0,01 |
3,2±0,4 р4-5<0,001 р4-6<0,001 |
5,9±0,1↑ |
6,4±0,2↑ |
|
кл/109/л |
0,06±0,01 р1-5<0,05 р1-6<0,01 |
0,04±0,01 р2-5<0,001 р2-6<0,001 |
0,08±0,02 |
0,1±0,02 |
0,12±0,02 |
0,12±0,01 |
|
|
CD25+ лимфоциты |
% |
7,4±0,7 р1-5<0,01 р1-6<0,01 |
7,9±0,8 р2-5<0,05 р2-6<0,05 |
8,1±1,0 р3-5<0,05 р3-6<0,05 |
8,2±0,9 р4-5<0,05 р4-6<0,05 |
11,6±0,4↑ |
12,0±1,0↑ |
|
кл/109/л |
0,17±0,03 |
0,16±0,05 |
0,19±0,04 |
0,18±0,05 |
0,22±0,01 |
0,2±0,03 |
|
|
CD3+ CD25+ лимфоциты |
% |
5,1±0,5 р1-5<0,001 р1-6<0,01 |
5,2±0,6 р2-5<0,01 р2-6<0,01 |
4,9±0,7 р3-5<0,01 р3-6<0,05 |
5,3±0,4 р4-5<0,001 р4-6<0,01 |
8,7±0,2↑ |
9,0±0,6↑ |
|
кл/109/л |
0,11±0,01 р1-5<0,01 |
0,10±0,02 р2-5<0,01 |
0,12±0,01 р3-5<0,05 |
0,11±0,03 р4-5<0,05 |
0,18±0,02 |
0,17±0,05 |
|
|
CD3+CD95+ лимфоциты |
% |
6,5±0,7 р1-5<0,05 р1-6<0,01 |
6,3±0,6 р2-5<0,05 р2-6<0,01 |
7,1±0,8 р3-5<0,05 р3-6<0,01 |
7,2±0,5 р4-5<0,05 р4-6<0,01 |
9,4±0,8↑ |
9,7±0,4↑ |
|
кл/109/л |
0,14±0,03 |
0,13±0,04 |
0,12±0,03 |
0,14±0,02 |
0,17±0,03 |
0,16±0,02 |
|
|
HLA-DR+ лимфоциты |
% |
14,2±1,2 р1-5<0,01 р1-6<0,01 |
13,8±1,3 р2-5<0,05 р2-6<0,05 |
16,1±1,5 р3-5<0,001 р3-6<0,001 |
15,6±1,0 р4-5<0,001 р4-6<0,01 |
8,2±0,9↓ |
8,0±0,8↓ |
|
кл/109/л |
0,29±0,04 р1-5<0,05 р1-6<0,05 |
0,28±0,05 р2-5<0,05 р2-6<0,05 |
0,3±0,04 р3-5<0,01 р3-6<0,01 |
0,29±0,04 р4-5<0,05 р4-6<0,05 |
0,15±0,04 |
0,14±0,03 |
|
|
CD3+HLA-DR+ лимфоциты |
% |
4,7±0,4 р1-5<0,001 р1-6<0,001 |
4,4±0,5 р2-5<0,01 р2-6<0,01 |
4,5±0,3 р3-5<0,001 р3-6<0,001 |
4,6±0,4 р4-5<0,001 р4-6<0,001 |
1,8±0,3↓ |
2,0±0,2↓ |
|
кл/109/л |
0,1±0,02 р1-5<0,05 р1-6<0,05 |
0,09±0,02 р2-5<0,05 |
0,09±0,01 р3-5<0,05 р3-6<0,05 |
0,1±0,02 р4-5<0,05 р4-6<0,05 |
0,04±0,01↓ |
0,05±0,01↓ |
|
Примечание: статистическая значимость различий между исследуемыми группами р1,2,3,4,5,6 и периодом до введения БТА не установлена.
Таким образом, динамический анализ основных маркеров иммунокомпетентных клеток показал отсутствие влияния применяемых для коррекции гипермимических морщин доз БТА у женщин всех трех возрастных групп.
Выводы. Таким образом, подводя итог данным, полученным при решении вопроса о состоянии основных показателей иммунного статуса у женщин разных возрастных периодов с оценкой возможного влияния БТА, применяемого с целью коррекции гипермимических морщин, можно констатировать, что у женщин пожилого возраста определяются увеличение удельного веса В-лимфоцитов и снижение Т-клеток с дефицитом Т-хелперов, обусловленным усилением готовности Т-лимфоцитов к апоптозу, нарушением процессов позитивной активации лимфоцитов, и компенсаторное увеличение NКТ-лимфоцитов.
Не выявлено количественных нарушений показателей фагоцитоза и функциональной активности В-лимфоцитов по уровню иммуноглобулинов основных классов у этой категории женщин. Применение БТА в дозе от 100 до 150 ед не влияет на исследованные показатели иммунного статуса.