Scientific journal

Modern problems of science and education

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

Для оценки эндогенной интоксикации организма при самых разных патологических состояниях широко используется определение в биологических жидкостях и тканях ряда близких по смыслу лабораторных показателей, именуемых фракцией средней молекулярной массы, или веществами низкой и средней молекулярной массы, или просто «средними молекулами». В последнее время их преобладающим названием стало «молекулы средней массы» (МСМ) [1-3], которого мы и будем придерживаться.

Наши предыдущие исследования показали, что внутривенное введение крысам растворов рибозы сразу после реанимации благоприятно влияет на ряд биохимических показателей [4; 5]. В продолжение этих работ целесообразно было проверить влияние рибозы на один из интегральных показателей эндотоксикоза – МСМ, поскольку эндотоксикоз играет важную роль в патогенезе постреанимационной болезни, а в доступной литературе мы не обнаружили данных о влиянии рибозы на МСМ и другие показатели эндотоксикоза.

Цель исследования – выяснить, как изменяется уровень МСМ в крови в раннем постреанимационном периоде, а также проверить возможность влияния на него рибозы у реанимированных и здоровых животных.

Материалы и методы

Все исследования проводились в соответствии с этическими принципами Хельсинкской декларации о гуманном отношении к животным и нормативными документами, рекомендованными Европейским научным фондом (ESF). Эксперименты были выполнены на 42 неинбредных белых крысах-самцах, которые содержались в виварии на стандартном рационе и свободном доступе к воде. Из них 24 животных, наркотизированных диэтиловым эфиром, подвергли клинической смерти путем 6,5-минутной механической асфиксии с последующей реанимацией, заключающейся в проведении искусственного дыхания и непрямого массажа сердца. 8 крыс из 24 реанимировать не удалось, а 16 успешно реанимированных животных разделили на группы «Реанимация» и «Реанимация + Рибоза». Остальное 18 крыс были подвергнуты не асфиксии, а только контрольным манипуляциям: наркозу, фиксации, интубации; их разделили на группы «Контроль» и «Рибоза».

У животных всех групп через 30 мин после начала реанимации или контрольных манипуляций фиксировали в жидком азоте кровь. Для этого под эфирным наркозом быстро рассекали грудную клетку и отрезали сердце – тем самым производилась эвтаназия животных. Кровь стекала в жидкий азот, застывая в виде шариков. Эту замороженную кровь собирали затем, не размораживая, и обрабатывали как твердую ткань, ведя пересчет показателей не на единицу объема, а на грамм цельной крови. За 25 мин до эвтаназии всем крысам вводили в бедренную вену 0,9%-ный раствор NaCl из расчета 2,5 мл ^. кг^–1 массы тела. Раствор, предназначенный для групп «Реанимация + Рибоза» и «Рибоза» содержал, кроме того, D-(–)-рибозу производства компании Fluka AG, Buchs SG (Швейцария) в дозе 50 мг × кг^–1 массы тела.

В замороженном состоянии гомогенизировали навеску крови в холодной 6%-ной хлорной кислоте (НClO₄), взятой в соотношении 100 мг ткани на 0,4 мл НClO₄. Хлорнокислый гомогенат центрифугировали в течение 5 мин при 1000 g и 0 °С. Полученный безбелковый супернатант имеет кислую реакцию (рН = 1). В одной из аликвот нейтрализовали его раствором КОH до pH = 7, выдерживали 15 мин при 0 °C и осадок перхлората калия (KClO₄) отделяли центрифугированием при вышеописанных условиях. В другой аликвоте оставляли экстракт кислым (рН = 1). Из полученных таким образом экстрактов крови удаляли органические фосфаты по методике [6], чтобы приблизить биохимические характеристики наших экстрактов цельной крови к характеристикам биологических жидкостей, в которых обычно определяют МСМ – плазмы, сыворотки крови, мочи. Затем при рН = 7 и рН = 1 снимали спектры полученных бесфосфатных экстрактов в области 230-290 нм. Кроме регистрации оптических плотностей (А₂₃₀ - А₂₉₀), вычисляли их соотношения при 250 нм и 260 нм (А₂₅₀/А₂₆₀), 280 нм и 260 нм (А₂₈₀/А₂₆₀), 290 нм и 260 нм (А₂₉₀/А₂₆₀). Известно, что соотношения оптических плотностей МСМ являются информативными показателями при изучении эндотоксикоза [3; 7; 8].

Статистическую обработку цифровых данных проводили при помощи статистического пакета Statistica 6.0 производства компании Stat Soft Inc., США. Вычисляли медиану (Me), а также нижний и верхний квартили (Q₁ и Q₃) для каждой выборки (группы животных). Затем выполняли сравнение формы распределения двух попарно не связанных выборок по непараметрическому критерию Вальда-Вольфовица, сравнение двух попарно не связанных выборок по их средним тенденциям при помощи критерия Колмогорова-Смирнова в пакете Statistica 6.0, а также при помощи непараметрического критерия Вилкоксона-Манна-Уитни, уровни значимости для которого брали из таблиц [9].

Результаты исследования и их обсуждение. Установлено, что через 30 мин после начала реанимации происходит уменьшение оптической плотности экстрактов крови крыс по сравнению с контролем во всей исследованной области спектра (А₂₃₀ - А₂₉₀) при нейтральном рН (табл. 1 и 2). При этом снижение медианных значений наблюдается при 230 нм в 1,5 раза, при 240 нм в 1,8 раза, при 250 нм в 2,1 раза, при 270 нм в 1,6 раза, при 280 нм в 1,5 раза, и при 290 нм в 1,6 раза. При измерении в кислой среде значительное снижение оптической плотности в группе «Реанимация» по сравнению с группой «Контроль» наблюдается лишь при 240 нм – в 1,5 раза, и при 260 нм – в 1,4 раза (табл. 3 и 4). Во всех случаях статистическая значимость различий не достигает уровня Р = 0,05 из-за высокой внутригрупповой вариабельности показателя. Снижения внутригрупповой вариабельности в будущих исследованиях можно добиться путем использования линейных животных, характеризующихся меньшей вариабельностью по сравнению с нелинейными крысами, которых мы применяли в настоящей работе.

Таблица 1

Оптическая плотность экстракта крови крыс в области 230-260 нм (А₂₃₀ - А₂₆₀) при рН = 7 через 30 мин после реанимации. Влияние рибозы (50 мг × кг^–1 массы тела) на реанимированных и здоровых животных

Таблица 2

Оптическая плотность экстракта крови крыс в области 270-290 нм (А₂₇₀ - А₂₉₀) при рН = 7 через 30 мин после реанимации. Влияние рибозы (50 мг × кг^–1 массы тела) на реанимированных и здоровых животных

Таблица 3

Оптическая плотность экстракта крови крыс в области 230-260 нм (А₂₃₀ - А₂₆₀) при рН = 1 через 30 мин после реанимации. Влияние рибозы (50 мг × кг^–1 массы тела) на реанимированных и здоровых животных

Таблица 4

Оптическая плотность экстракта крови крыс в области 270-290 нм (А₂₇₀ - А₂₉₀) при рН = 1 через 30 мин после реанимации. Влияние рибозы (50 мг × кг^–1 массы тела) на реанимированных и здоровых животных

Примечания к таблицам 1-4:

результаты в таблицах приводятся в виде: медиана (нижний и верхний квартили), Me (Q₁-Q₃), и выражены в единицах оптической плотности × г ^-1 сырой массы крови;

n – объем выборки (число крыс в группе).

Как показали наши результаты (табл. 1-4), зависимость спектральных характеристик МСМ от рН в ряде случаев очень сильно выражена, что необходимо всегда учитывать при проведении измерений МСМ. Это объясняется физическими свойствами веществ, входящих в состав МСМ. В качестве примера в таблице 5 мы обобщили литературные данные (в частности, [10; 11]) о положениях максимумов поглощения и величинах отношений А₂₅₀/А₂₆₀, А₂₈₀/А₂₆₀ и А₂₉₀/А₂₆₀ при кислом и нейтральном рН у пуриновых нуклеозидов и азотистых оснований, являющихся компонентами МСМ.

Таблица 5

Влияние рН на спектральные характеристики пуриновых оснований и нуклеозидов

Далее было установлено, что соотношения оптических плотностей А₂₅₀/А₂₆₀ при рН = 1 в группе «Реанимация» в 2,5 раза ниже уровня группы «Контроль» (при сравнении медиан этих групп), причем это различие статистически значимо по критерию Вилкоксона-Манна-Уитни (Р = 0,05). Это наше наблюдение подтверждается литературными данными о повышении А₂₆₀ и снижении А₂₅₀, полученными при изучении различной патологии. Так, например, статистически значимое повышение оптической плотности МСМ при 260 нм в крови крыс обнаружено при черепно-мозговой травме [12]. Статистически значимое повышение оптической плотности МСМ при 260 нм выявлено в сыворотке крови больных метаболическим синдромом с клиническими проявлениями кардиоваскулярной патологии [8]. Снижение более чем в 4 раза оптической плотности МСМ при 250 нм в эритроцитах крыс было обнаружено при остром отравлении верапамилом [13].

На среднегрупповой уровень МСМ оказывает влияние важный фактор, который обычно выпадает из внимания авторов медицинских исследований. Этот фактор – пропуски в данных, вызванные гибелью части особей от изучаемой патологии [4; 5]. Мы уже отмечали выше, что из 24 крыс, подвергнутых 6,5-минутной асфиксии, нам не удалось реанимировать 8 животных, или 33,3%. Из 16 успешно оживленных крыс (это 66,7% от 24 исходных крыс, подвергнутых асфиксии и реанимации) 10 животных были включены в группу «Реанимация», но из них 2 крысы погибли в течение первых 30 минут постреанимационного периода, не дожив до забора крови. Эти 2 особи составляют 20% от оживленных крыс группы «Реанимация» или 13,3% от исходных животных (66,7 ^. 0,2 = 13,3). Таким образом, итоговое различие между группами «Реанимация» и «Контроль» по пропускам, вызванным гибелью животных от изучаемой патологии, равно: 33,3 + 13,3 = 46,6%.

Как любой биологический показатель, уровень МСМ в организме имеет естественную вариабельность, поэтому исходные значения этого показателя среди крыс, взятых нами в опыт, различались от особи к особи. Учитывая патогенетическое значение МСМ [7; 8; 13], логично предположить, что животные с изначально высокими содержаниями в организме (а значит и в крови) МСМ имеют меньше шансов выжить, поскольку во время асфиксии и реанимации всегда дополнительно образуются эндотоксины и количество последних может превысить порог, совместимый с жизнью. Таким образом, можно полагать, что 46,6% погибших животных в группе «Реанимация» представлены преимущественно крысами с изначально высокими уровнями МСМ, а 53,4% выживших крыс в основном имели низкие уровни МСМ перед опытом. Удаление из группы высоких цифр приводит к снижению среднегруппового уровня МСМ у выживших животных в группе «Реанимация».

В группе «Реанимация + Рибоза» в течение первых 30 минут постреанимационного периода не погибло ни одной крысы из шести. Таким образом, различие между группами «Реанимация» и «Реанимация + Рибоза» по постреанимационной летальности равно 20%. Эти 20% выживших особей имеют, скорее всего, самые высокие уровни МСМ в группе «Реанимация + Рибоза». D-рибоза, приводя к доживанию крыс до 30 минут после реанимации, тем самым, вероятно, сохраняет в группе «Реанимация + Рибоза» особей с высокими концентрациями МСМ в крови, что приводит к возрастанию среднегруппового уровня МСМ по сравнению с группой «Реанимация» при нескольких длинах волн (табл. 1-4). Введение D-рибозы здоровым животным в дозе 50 мг × кг^–1 массы тела не оказывает влияния на А₂₃₀ - А₂₉₀ экстракта крови крыс (табл. 1-4).

Заметим, что во многих исследованиях, в том числе и в нашем, имеют место еще и случайные пропуски в данных, например нечаянная утрата биоматериала от нескольких животных. Такие пропуски не влияют на результаты и выводы исследования, если проводить (как мы делали) обработку материала не группа за группой, а в случайном порядке, соблюдая рандомизацию на всех этапах работы.

Литературные данные, собранные в обобщающих публикациях [4; 5; 14], свидетельствуют о благоприятном эффекте D-рибозы при различных патологических состояниях. В том числе этот моносахарид при схеме введения, использованной в настоящей работе (50 мг × кг^–1 массы тела сразу после реанимации), оказывал корригирующее действие на ряд биохимических и физиологических показателей крыс, реанимированных после 6,5-минутной асфиксии [4; 5]. Однако, как показало настоящее исследование, положительные эффекты D-рибозы в постреанимационном периоде реализуются не через влияние на накопление МСМ в крови, а через воздействие на другие патогенетические механизмы, в частности через процессы, изучавшиеся нами в работах [4; 5; 15].

Заключение

Таким образом, учет пропусков, вызванных изучаемой патологией, позволил объяснить удивительные, на первый взгляд, факты снижения уровня МСМ у реанимированных животных по сравнению с контрольными, а также повышение МСМ в постреанимационном периоде под влиянием рибозы.