Scientific journal

Modern problems of science and education

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

Стволовые/прогениторные клетки, в том числе и мезенхимные стволовые клетки (МСК), разновидность мультипотентных стволовых клеток имаго, находят применение в регенеративной медицине для лечения воспалительно-дегенеративных процессов органов и тканей [1-3]. Показано, что МСК мобилизуются из костного мозга в периферическое кровеносное русло и мигрируют в другие органы и ткани в ответ на повреждение, например ожог, разрыв мышечной ткани, гипоксию и воспаление. МСК продуцируют широкий спектр биологически активных веществ, включая цитокины, ростовые факторы, хемокины и мессенджеры межклеточного взаимодействия, например оксид азота, что может быть использовано для регенеративной медицины [1-3]. Часто в основе дегенеративно-воспалительных заболеваний лежит окислительный стресс [4]. Терапевтический потенциал клеточной терапии стволовыми/прогениторными клетками связан с фенотипом, пролиферацией, миграцией и секрецией биологически активных веществ, в том числе и цитокинов, а также с выживаемостью имплантированных клеток в поврежденный орган или ткань в условии неблагоприятного микроокружения для стволовых/прогениторных клеток [5; 6]. Так, недостаток кислорода и воспаление в зоне патологического процесса могут вызывать гибель вводимых стволовых/прогениторных клеток и снижать их функциональную активность [4]. Показано, что эритропоэтин повышает выживание клеток при гипоксии [7]. Кроме этого, известно, что эритропоэтин способствует эндотелиальной дифференцировке, увеличению экспрессии факторов дифференцировки стволовых клеток, увеличению продукции проангиогенных факторов [5; 6], уменьшению апоптоза [8]. Кратковременная преинкубация стволовых клеток с эритропоэтином увеличивает пролиферацию, миграцию, формирование сосудисто-подобных структур in vitro [9]. Однако эффект эритропоэтина на морфофункциональные свойства мезенхимных стволовых клеток изучен недостаточно.

Цель исследования – оценить эффект эритропоэтина на пролиферацию, апоптоз, клеточный цикл и экспрессию рецептора к эритропоэтину мезенхимными стволовыми клетками при оксидативном стрессе.

Материал и методы исследования. Исследование проведено на костномозговых МСК больных с ишемической болезнью сердца с функциональным классом сердечной недостаточности по NYHA II-III класса, давших информированное согласие. Аспират костного мозга забирали из подвздошной кости традиционным способом под местной анестезией. Мононуклеарные клетки выделяли из костного мозга на градиенте плотности фиколл/верографин (ρ=1,077 г/л). Для получения МСК мононуклеарные клетки культивировали в пластиковых флаконах (TPP, Швейцария) в среде DMEM, дополненной 80 мкг/мл гентамицина сульфата, 2 мM L-глютамина и 10% FCS при 37 °С в атмосфере 5% СО₂. Через 48 часов неприкрепленные к пластику клетки удаляли, а прилипающую фракцию клеток культивировали до получения конфлюэнтного монослоя (80-90%). Снятие КМ-МСК при пассировании осуществляли с использованием 0,25% раствора трипсина/0,02% раствора ЭДТА. В экспериментах использовали МСК от 4 пассажа. Фенотип МСК до и после экспозиции с эритропоэтином исследовали на проточном цитофлуориметре FACSCanto II (BD, США) с использованием моноклональных антител, меченных FITC, PE или APC к CD73, CD90, CD105, CD34 и CD45 (BD, США), рецептору эритропоэтина (BioLegend, США). Экспозицию МСК с эритропоэтином (Рекормон, Швейцария, в дозе 33,4 МЕ/мл) проводили в течение 24 часов, после этого клетки снимали с использованием 0,25% раствора трипсина/0,02% раствора ЭДТА, отмывали в забуференном физиологическом растворе и использовали для оценки фенотипа, экспрессии рецептора к эритропоэтину, пролиферации, апоптоза, клеточного цикла. Клеточный цикл МСК исследовали с использованием пропидиума иодида (BD, США) и апоптоз с использованием Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (BD, США). При анализе нахождения МСК в фазе клеточного цикла выделяли следующие фазы: subG0G1 (клетки с гиподиплоидным набором хромосом, <2n); G0G1 (клетки с диплоидным набором хромосом, фаза покоя/начального роста, 2n); G2/M (клетки с гиперплоидным набором хромосом, фаза подготовки к митозу/митоз, 2n-4n); S (клетки с гиперплоидным набором хромосом, фаза синтеза/репликации ДНК клеточного ядра, >4n). При анализе нахождения МСК в апоптозе выделяли следующие гейты: некроз (мертвые клетки, окрашенные красителем для нуклеиновых кислот йодистым пропидием), ранний апоптоз (клетки, имеющие нарушение «фосфолипидной асимметрии» мембраны и появление фосфатидилсерина на наружном слое мембраны, выявляемого взаимодействием с антикоагулянтом Аннексином V), апоптоз (клетки позитивные на фосфатидилсерин и нуклеиновые кислоты). Окислительный стресс индуцировали внесением к МСК 2 мМ перекиси водорода, экспозицией в течение 60 минут, отмывкой клеток от перекиси водорода, с последующим использованием МСК для оценки пролиферации, апоптоза и экспрессии рецептора к эритропоэтину. Спонтанную пролиферацию 2х10⁵ МСК/лунку в питательной среде ДМЕМ («Биолот», Россия) с добавлением 10% FCS (фетальной сыворотки плода, Hyclone, США), 2мМ L-глутамина (ICN, США) и 80 мкг/мл гентамицина («Дальхимфарм», Россия) исследовали по включению 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолиум бромида (МТТ, Sigma, США) на спектрофотометре Stat Fax 2100 (США). 2х10⁵ МСК/лунку, подвергшихся предварительному воздействию окислительного-стресса, культивировали в питательной среде ДМЕМ с добавлением 10% FCS, 2мМ L-глутамина, 80 мкг/мл гентамицина и эритропоэтина (0 и 33,4 МЕ/мл «Рекормон», Швейцария) исследовали по включению 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолиум бромида. Кроме этого, оценивали пролиферацию 2х10⁵ МСК/лунку, предварительно проинкубированных с эритропоэтином в течение 24 часов, отмытых от эритропоэтина и далее росших в питательной среде с добавлением 2 мМ перекиси водорода. Статистическую обработку данных проводили с использованием программы Statistica 6.0 for Windows (Stat Soft, США). Полученные данные проверяли на нормальность распределения согласно W-критерию Шапиро-Уилкса, меры центральной тенденции и рассеяния описаны медианой (Ме), нижним (Lq) и верхним (Uq) квартилями; достоверность различий рассчитывалась по U-критерию Манна-Уитни и принималась при значениях p<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение. Фенотипически клетки, выделенные из костного мозга больных ИБС, соответствовали критериям, предъявляемым для мезенхимных стволовых клеток: экспрессировали CD90, CD73, CD105 и не несли на своей мембране маркер гемопоэтических стволовых клеток CD34 и CD45.

Известно, что функциональная активность МСК зависит от условий микроокружения, в частности от гипоксии [4]. При индукции окислительного стресса перекисью водорода отмечено значимое снижение пролиферативного потенциала МСК по сравнению с контролем (p<0,05; табл. 1). Культивирование МСК, предварительно подвергшихся влиянию перекиси водорода, в присутствие эритропоэтина не оказывало значимого влияния на пролиферативный потенциал МСК (p>0,05).

В то же время для МСК, предварительно подвергшихся влиянию эритропоэтина в течение 24 часов, наличие перекиси водорода в питательной среде не вело к снижению пролиферативного потенциала МСК, который был значимо выше по сравнению с пролиферацией МСК после индукции окислительного стресса с последующим ростом в питательной среде с наличием или отсутствием эритропоэтина (p<0,05).

Однако наличие перекиси водорода в питательной среде с МСК, предварительно подвергшихся влиянию эритропоэтина в течение 24 часов, вело к существенному снижению уровня пролиферации клеток по сравнению с аналогичным параметром для клеток, росших в присутствии эритропоэтина (p<0,05).

Показано, что окислительный стресс увеличивал апоптоз МСК по сравнению с контролем (p<0,05). Кроме этого, при окислительном стрессе увеличена доля некротических МСК по сравнению с контролем (p<0,05). Наличие в питательной среде для МСК эритропоэтина также способствовало росту апоптоза и некроза по сравнению с контролем (p<0,05), но уровень апоптоза/некроза значимо меньше, чем после индукции окислительного стресса.

Предобработка МСК эритропоэтином с последующим культивированием в питательной среде с добавлением перекиси водорода или же наличие эритропоэтина в питательной среде для МСК, подвергшихся предварительно влиянию окислительного стресса, не отменяло увеличение апоптоза и некроза МСК по сравнению с аналогичными показателями МСК после индукции окислительного стресса.

Таблица 1

Эффект эритропоэтина на пролиферацию и апоптоз/некроз костномозговых мезенхимных стволовых клеток в норме и при индукции окислительного стресса

Примечание: * - достоверность различий с контролем; # - достоверность различий с окислительным стрессом; $ - достоверность различий с эритропоэтином; ^ - достоверность различий с окислительным стрессом + эритропоэтин; p<0,05.

Дополнительно нами исследовано влияние окислительного стресса на клеточный цикл МСК (табл. 2). Окислительный стресс увеличивал долю МСК в subG0G1 (апоптоз) фазе клеточного цикла (p<0,05), но не оказывал существенного влияния на долю клеток в G0G1, G2/M и S фазах клеточного цикла.

В то же время нами показано, что наличие в питательной среде эритропоэтина для МСК, предварительно подвергшихся окислительному стрессу, увеличивало долю клеток в S фазе клеточного цикла по сравнению с контролем (p<0,05).

Кроме этого, показано, что после инкубации МСК с эритропоэтином на мембране клеток увеличена экспрессия рецептора к эритропоэтину в 2 раза (0,2/0,15-0,2 в контроле и 0,4/0,35-0,45 после инкубации с эритропоэтином; p=0,03), что согласуется с результатами исследования в работе авторов, также показавших, что эритропоэтин способствует экспрессии рецептора к эритропоэтину на клетках в ответ на взаимодействие с ним [6].

Таблица 2

Эффект эритропоэтина на клеточный цикл костномозговых мезенхимных стволовых клеток в норме и при индукции окислительного стресса

Примечание: *достоверность различий с контролем; p<0,05.

Сохранность пролиферации, снижение апоптоза/некроза МСК, предобработанных эритропоэтином, в условиях окислительного стресса согласуются с данными других исследователей. Полученные нами из костного мозга больных ишемической болезнью сердца МСК соответствуют требованиям Комитета мезенхимных и тканевых стволовых клеток Международного сообщества по клеточной терапии (ISCT) [2], а именно прикрепляются к пластику: несут на мембране кластеры дифференцировки CD73, CD90, CD105 и не экспрессируют CD45, CD34, CD14, CD11b, CD79a, CD19 и HLA-DR; дифференцируются в остеокласты и хондроциты in vitro.

Показано, что преинкубация МСК человека с эритропоэтином защищает клетки от ишемии в модели in vitro, при этом существенная роль в выживании клеток отводится наличию на мембране клеток рецептора к эритропоэтину. Более того, было показано, что индуцированный перекисью водорода апоптоз в МСК значимо снижался после преинкубации МСК с эритропоэтином (63,03 ± 4,96% и 29,0 ± 3,41% соответственно для контроля и для преинкубированных с эритропоэтином клеток) [9].

В то же время костномозговые МСК крыс Wistar при наличии эритропоэтина в питательной среде в условиях окислительного стресса, инициированного перекисью водорода, увеличивают пролиферацию и подавляют миграцию, и не оказывают существенного влияния на уровень продукции оксида азота [10].

Известно, что эритропоэтин проявляет нейротрофическое, антиоксидантное, анти-апоптотическое и противовоспалительное действие. Так, трансдукция гена эритропоэтина в МСК приводила к стойкой продукции клетками эритропоэтина [11]. Инкубация МСК с 10 МЕ/мл эритропоэтина способствовала продукции клетками эритропоэтина схожего с уровнем продукции эритропоэтина МСК с внедренным в них геном эритропоэтина. Оба типа клеток предохраняли от окислительного стресса, индуцированного перекисью водорода и от апоптоза, индуцированного стауроспорином, но защитный эффект более выражен у МСК с внедренным геном эритропоэтина [11].

О наличии влияния эритропоэтина на клетки не эритроидного ряда сообщается в работе [7]. Показано защитное действие эритропоэтина (300 МЕ/кг, трижды в неделю в течение 4 недель) на диабет-ассоциированные когнитивные расстройства у диабетических крыс, приводящее к улучшению пространственной ориентации и обучаемости крыс. Кроме этого, авторы показали, что эритропоэтин повышал выживаемость и активность супероксиддисмутазы, снижал продукцию малонового альдегида и активных форм кислорода, а также снижал апоптоз РС12 клеток при индукции гипергликемии и окислительного стресса [12]. Кроме этого, показано, что эритропоэтин способствует увеличению экспрессии рецептора эритропоэтина, активности фосфатидилинозитола-3, фосфорилированию Akt2 и снижению активности гликогенсинтазокиназы - 3β [12].

Кроме этого, цитопротекторный эффект эритропоэтина опосредуется через комплекс рецептор к эритропоэтину/CD131. Показано, что антиапоптотический и противовоспалительный эффект эритропоэтина осуществляется через выпячивание на мембране клеток CD131 как ответ на клеточный стресс [13]. Авторы также показали, что воздействие через комплекс рецептор к эритропоэтину/CD131 существенно влияет на транскрипционные, трансляционные и метаболические реакции клеток после отмены стресса. Так, синтетический короткий пептид ARA290 преодолевал TNFα – опосредованное подавление активации фактора транскрипции, связанного со стрессовыми реакциями клеток, в первую очередь с фактором ответа сыворотки крови (SRF), белком фактора транскрипции теплового шока 1 (HSF1) и белком активатора 1 (AP1) [13].

Показано, что инкубация эндотелиальных прогениторных клеток с эритропоэтином ведет к увеличению экспрессии рецептора к эритропоэтину и CD131, которые ковалентно связаны на мембране клеток. Более того, эритропоэтин в дозе 5 МЕ/мл значимо стимулировал пролиферацию, заживление дефекта монослоя клеток, миграцию и формирование сосудистоподобных структур эндотелиальными прогениторными клетками. Кроме этого, инкубация эндотелиальных прогениторных клеток с эритропоэтином повышает устойчивость клеток к индуцированному перекисью водорода апоптозу [6].

Таким образом, преинкубация клеток с эритропоэтином способствует уменьшению негативного влияния окислительного стресса на пролиферацию, апопотоз и распределение МСК в фазах клеточного цикла. Полученные данные по наличию антиоксидантного влияния эритропоэтина на МСК могут быть использованы в регенеративной медицине с целью повышения терапевтического потенциала стволовых клеток при имплантации их в неблагоприятное микроокружение в поврежденных органах и тканях.

Выводы

1. Преинкубация мезенхимных стволовых клеток с эритропоэтином отменяет негативный эффект окислительного стресса на пролиферативный потенциал клеток, а также снижает апоптоз/некроз таких клеток.
2. Протекторное действие эритропоэтина на пролиферацию мезенхимных стволовых клеток, подвергшихся окислительному стрессу, не выявлено, но при этом снижается доля клеток в раннем апоптозе и доля мертвых клеток.
3. Эритропоэтин существенно не оказывал влияния на нахождение мезенхимных клеток, подвергшихся окислительному стрессу, в фазах клеточного цикла.
4. Преинкубация мезенхимных клеток с эритропоэтином усиливает экспрессию рецептора к эритропоэтину на клеточной мембране.