Scientific journal

Modern problems of science and education

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

Гемобластозы, распространенность которых значительно возросла в последние десятилетия, представляют значительную медико-социальную проблему во всем мире. Так, например, заболеваемость хроническим лимфолейкозом (ХЛЛ) в США составляет 4,1 на 100 тыс. населения [1]. Возраст, в котором диагностируется это заболевание, составляет в большинстве случаев 67–72 года, хотя в последние десятилетия отмечено увеличение доли более молодых пациентов (моложе 40 лет) с ранними стадиями ХЛЛ и минимальными симптомами, что, вероятно, является результатом более часто проводимых исследований крови по разным показаниям [2; 3]. Заболеваемость хроническим миелолейкозом (ХМЛ) ниже – 1–2 случая на 100 тыс. населения, что составляет примерно 15% от вновь выявляемых лейкемий у взрослых [4]; в России ежегодная заболеваемость ХМЛ варьирует от 0,6 до 1,9 случая на 100 тыс. населения [5]. Учитывая увеличение продолжительности жизни в развитых странах, следует ожидать, что заболеваемость и смертность от ХЛЛ и ХМЛ будут постоянно расти.

Несмотря на определенные успехи в диагностике и лечении ХЛЛ и ХМЛ, основанные на понимании основных звеньев патогенеза этих неоплазий, многие вопросы, касающиеся прогрессии и резистентности опухолевых клеток к химиотерапии, остаются не выясненными. По данным многочисленных исследований, инициация опухолевой трансформации костномозговых клеток возникает чаще всего в результате хромосомных мутаций (в частности, делеций, транслокаций, амплификаций, трисомий) [6–9], а их дальнейшая прогрессивная пролиферация, способность к метастазированию и даже устойчивость к химиотерапии во многом определяются костномозговым клеточным микроокружением [10–13]. Подобно нормальным стволовым гемопоэтическим клеткам, опухолевые стволовые клетки (так называемые лейкемические клетки) также располагаются в нишах костномозгового микроокружения, в которых поддерживаются их пролиферация и выживание, хотя, по некоторым данным, роль клеток микроокружения в поддержании их витальных функций ниже, чем для гемопоэтических клеток [14].

К основным клеточным популяциям костномозгового микроокружения, образующим ниши, относятся жировые клетки, остеобласты/остеокласты, фибробласты, макрофаги, эндотелиальные клетки, которые секретируют различные цитокины (интерлейкины 1, 6, фактор некроза опухолей α), факторы роста, адипокины, хемокины и др. [13; 15] и через аутокринную, паракринную и эндокринную регуляцию влияют на созревание и функциональную активность как нормальных, так и опухолевых клеток. Экспериментально установлено, что некоторые изменения клеток костномозгового микроокружения могут усиливать выживание опухолевых клонов и даже способствовать их дальнейшей мутагенной трансформации [16].

Костномозговое микроокружение, кроме клеток мезенхимального происхождения, представлено также внеклеточным матриксом, образованным биомолекулами-регуляторами процессов пролиферации, дифференцировки, выживания как гемопоэтических стволовых и прогенеторных клеток, так и опухолевых клонов [13]. Показано также, что для лимфопролиферативных и миелопролиферативных заболеваний в ряде случаев характерно развитие миелофиброза (МФ) разной степени выраженности [17–19], что может отражать как особенности патогенеза костномозговых неоплазий у отдельных индивидов, так и стадии заболевания.

Ранее были изучены взаимосвязи между параметрами системы эритрона, костномозгового микроокружения и выраженностью МФ при ХМЛ, множественной миеломе и ХЛЛ после химиотерапии [20]. Полученные данные свидетельствуют о том, что качественная и количественная оценка МФ имеет большое значение для прогноза гемобластозов и понимания их патогенеза, а также открывает новые перспективы для разработки лекарственных препаратов, необходимых для комбинированной терапии. В то же время многие вопросы, касающиеся взаимообусловленных изменений костномозгового микроокружения, опухолевой прогрессии и разных звеньев гемопоэза, все еще остаются малоизученными. В частности, мало изучены количественные изменения гранулоцитарного и мегакариоцитарного звеньев гемопоэза в зависимости от выраженности МФ.

Цель исследования – установление взаимосвязей между количественными показателями мегакариоцитарного и гранулоцитарного ростков кроветворения и выраженностью и распространенностью МФ у пациентов с ХМЛ и ХЛЛ.

Материал и методы исследования

Проведено клинико-морфологическое обследование 53 пациентов с ХМЛ (38 мужчин, 15 женщин, средний возраст 55,8±1,9 года) и 110 пациентов с ХЛЛ (77 мужчин, 33 женщины, средний возраст 59,2±1,2 года) до начала химиотерапии. Все исследования выполнены с информированного согласия испытуемых и в соответствии с этическими нормами Хельсинкской декларации (2000), на проведение исследования получено разрешение Комитета по биомедицинской этике ФИЦ ФТМ.

Среди пациентов с ХЛЛ – в дебюте обследованы 90 больных (65 мужчин, 25 женщин, средний возраст 58,6±2,5 года), в рецидиве и прогрессии ХЛЛ – 20 пациентов (12 мужчин и 8 женщин, средний возраст 60,4±2,5 года). Дебют, рецидив и прогрессию ХЛЛ условно считали активной фазой заболевания. Диагноз ХМЛ и ХЛЛ устанавливали в соответствии с описанными ранее критериями [20]. Группу сравнения составили 10 человек без гематологических заболеваний (6 мужчин и 4 женщины, средний возраст 44,73±2,48 года). У всех пациентов определяли показатели центрального и периферического звеньев мегакариоцитарного и гранулоцитарного ростков с помощью цитологического исследования мазков периферической крови и костного мозга и патоморфологического изучения трепанобиоптатов подвздошной кости. У пациентов группы сравнения исследование костного мозга проводили для исключения диагноза гемобластоза.

Парафиновые срезы трепанобиоптатов подвздошной кости изготавливали по общепринятым методикам, импрегнировали серебром по Гомори, окрашивали по Ван Гизону. Абсолютную и относительную площадь (S_МФ) очагов фиброзной ткани, которая характеризовала распространенность МФ, рассчитывали, как описано ранее [17]. Отдельно высчитывали относительную площадь начального (ретикулинового) МФ0-1 (S_МФ0-1) и выраженного (коллагенового) МФ2-3 (S_МФ2-3).

Показатели центрального и периферического звеньев гемопоэза оценивали на мазках периферической крови и аспиратах костного мозга, окрашенных по Романовскому-Гимзе. Показатели гемограммы определяли на гематологическом анализаторе Sysmex XT-2000i. Подсчет клеток костного мозга проводили в камере Горяева (анализировали не менее 400 ядросодержащих клеток костного мозга). Подсчет мегакариоцитов в трепанобиоптатах подвздошной кости производили на срезах, окрашенных гематоксилином и эозином при увеличении в 400 раз; общее число мегакариоцитов представляло собой сумму данных, полученных при подсчетах в 20 случайных полях зрения.

Статистическую обработку данных проводили с помощью программы SPSS (версия 17.0). Вычисляли среднее арифметическое значение и ошибку среднего. Достоверность различий определяли с помощью U-теста по методу Манна и Уитни при уровне значимости p<0,05. Связь между переменными определяли с помощью коэффициентов корреляции Пирсона и Спирмена.

Результаты исследования и их обсуждение

По данным комплексного патоморфологического анализа, у 47% больных ХМЛ в трепанобиоптатах подвздошной кости МФ отсутствовал. В 24,5% случаев был выявлен начальный МФ (S_МФ0-1 = 17,7±6,3%), характеризовавшийся появлением небольшого числа одиночных ретикулярных волокон, хаотично расположенных в костном мозге. В 28% случаев выявлен выраженный МФ (S_МФ2-3 = 30,7±8,4%), характеризовавшийся формированием коллагеновых волокон, одиночных и собранных в пучки, которые занимали большие участки трепанобиоптатов.

Анализ миелограмм показал, что у всех пациентов ХМЛ (с МФ или без него) было существенно увеличено содержание мегакариоцитов в костном мозге и тромбоцитов в периферической крови (табл. 1). Общее количество мегакариоцитов в трепанобиоптатах при отсутствии МФ было увеличено в 33 раза, при начальном МФ – в 38 раз, при выраженном МФ – в 50 раз. Эти изменения были недостоверными, но они отражали тенденцию к выраженной пролиферации клеток мегакариоцитарного ряда. Особенно следует отметить появление в миелограммах больных ХМЛ карликовых мегакариоцитов, которые не выявлялись в группе сравнения. При этом по мере усиления выраженности МФ происходило заметное увеличение количества карликовых мегакариоцитов: при начальном МФ их количество возросло в 2,5 раза по сравнению с группой больных, у которой МФ отсутствовал (соответственно 129,5±56,7 и 52,0±22,5), при выраженном МФ данный показатель увеличился в 3,2 раза (до 167,4±29,4, p<0,05).

Таблица 1

Количественная характеристика мегакариоцитарно-тромбоцитарного звена гемопоэза
при хроническом миелолейкозе и хроническом лимфолейкозе (M±m)

Соответственно увеличению количества мегакариоцитов в костном мозге возрастало количество тромбоцитов в периферической крови. При отсутствии МФ их количество возрастало на 44%, при начальном МФ – в 1,9 раза, а при выраженном МФ – в 2 раза (табл. 1).

При ХМЛ обнаружена прямая корреляция между S_МФ1 и числом мегакариоцитов в костном мозге (r=0,619, p<0,05). При гранулоцитарном варианте опухолевой пролиферации выявлена прямая корреляционная связь между S_МФ1 и числом карликовых мегакариоцитов в трепанобиоптатах (r=0,703, p<0,05), между S_МФ2-3 и числом карликовых мегакариоцитов (r=0,643, p<0,05). При обоих вариантах – между S_МФ2-3 и числом мегакариоцитов в трепанобиоптатах (r=0,517, p<0,05).

У пациентов с ХЛЛ в активной фазе до начала лечения МФ не выявлен в 73% случаев, в 13% случаев выявлен начальный МФ (S_МФ0-1 = 19,2±5,7%), в 14% – выраженный МФ (S_МФ2-3 = 15,4±4,6%). Количество мегакариоцитов в трепанобиоптатах у пациентов из группы сравнения и пациентов с ХЛЛ без МФ практически не различалось (табл. 1). У пациентов с ХЛЛ и начальным МФ этот показатель был уменьшен как относительно группы сравнения, так и относительно группы без МФ (соответственно на 28 и 37%). Наименьшее количество мегакариоцитов в трепанобиоптатах было выявлено у пациентов с выраженным МФ (табл. 2): их количество было уменьшено соответственно на 46,5 и 53% относительно группы сравнения и группы без МФ.

Количество тромбоцитов в периферической крови также уменьшалось, в большей степени – у пациентов с начальным и выраженным МФ (соответственно на 42% и в 2 раза) (табл. 1). Относительно группы пациентов без МФ количество тромбоцитов в периферической крови было уменьшено у пациентов с начальным МФ на 49%, у пациентов с выраженным МФ – в 2,4 раза (p<0,05).

Корреляционный анализ выявил обратные корреляции между S_МФ1 и S_МФ2-3 и количеством мегакариоцитов в трепанобиоптатах (соответственно r=-0,596 и -0,412, p<0,05), а также между S_МФ1 и S_МФ2-3 и количеством тромбоцитов в периферической крови (соответственно r=-0,675 и -0,359, p<0,05).

При количественной оценке гранулоцитарного звена гемопоэза выявлено, что в хронической фазе ХМЛ в костном мозге у пациентов с начальным и выраженным МФ значительно возросло относительно группы сравнения содержание нейтрофильных клеток (на 27% в обоих случаях, p<0,05) и базофильных клеток (соответственно в 8 и 7 раз, p<0,05) (табл. 2). Происходило также увеличение содержания нейтрофилов (соответственно на 34 и 32%, p<0,05) и базофилов (соответственно в 4,5 и 4,8 раза, p<0,05) в периферической крови у пациентов с начальным и выраженным МФ относительно группы сравнения. Установлены прямые корреляционные связи между S_МФ1 и S_МФ2-3 и содержанием: нейтрофильных клеток в костном мозге (соответственно r=0,862 и r=0,846, p<0,05), содержанием базофильных клеток в костном мозге (соответственно r=0,822 и r=0,784, p<0,05), содержанием нейтрофилов в периферической крови (соответственно r=0,726 и r=0,754, p<0,05), содержанием базофилов в периферической крови (соответственно r=0,923 и r=0,898, p<0,05).

У пациентов с ХЛЛ содержание нейтрофильных клеток в костном мозге и периферической крови было значительно уменьшено по сравнению с группой сравнения (в костном мозге – в 2–3 раза, p<0,05; в периферической крови – в 2–3 раза, p<0,05) (табл. 2). Самые низкие показатели выявлены у пациентов с выраженным МФ. Содержание эозинофильных и базофильных клеток значимо не менялось. Обратные корреляционные связи выявлены между S_МФ1 и S_МФ2-3 и содержанием: нейтрофильных клеток в миелограмме (соответственно r=-0,562 и r=-0,446, p<0,05) и в периферической крови (соответственно r=-0,639 и r=-0,962, p<0,05).

Полученные данные свидетельствуют о значительных и разнонаправленных изменениях количественных показателей мегакариоцитарного и гранулоцитарного ростков дифференцировки костного мозга при ХМЛ и ХЛЛ. При ХМЛ происходит значительное увеличение пролиферативной активности мегакариоцитов и гранулоцитов в костном мозге, особенно при развитии МФ, что сопровождается увеличением процентного содержания соответственно тромбоцитов и гранулоцитов в периферической крови. При ХЛЛ, наоборот, по мере прогрессирования МФ происходит заметное подавление пролиферации как мегакариоцитов, так и гранулоцитов в костном мозге и, как следствие, уменьшение процентного содержания тромбоцитов и гранулоцитов в периферической крови (развитие тромбоцитопении и гранулоцитопении).

Механизмы столь значительных количественных изменений клеток мегакариоцитарного и гранулоцитарного ростков костного мозга при ХМЛ и ХЛЛ при прогрессировании МФ до сих пор не выяснены. Возможно, прогрессивное увеличение массы опухолевых клеток нарушает сложившиеся в костном мозге паренхиматозно-стромальные отношения в сторону десмопластических реакций. Постепенное замещение нормальных гемопоэтических клеток опухолевыми сопровождается метаболическим дисбалансом – повышенным синтезом провоспалительных цитокинов, факторов роста, что оказывает стимулирующее влияние на фибробласты. В этом аспекте некоторые полагают, что справедливо говорить не только об «онкогенезе, индуцированном микроокружением», но и о «микроокружении, индуцированном онкогенезом» [21]. Показано, в частности, что при гемобластозах, которые сопровождаются пролиферацией мегакариоцитов, в костном мозге происходит накопление трансформирующего фактора роста-β, который относится к стимуляторам синтеза коллагена фибробластами [22].

Несмотря на отсутствие полного понимания патогенеза МФ при гемобластозах, ряд авторов тем не менее, основываясь на данных ретроспективных исследований 5-летней выживаемости больных, рассматривает МФ как крайне неблагоприятный прогностический критерий [23; 24]. При начальном МФ (МФ0-1) общая выживаемость составляла 86,92%, а при выраженном МФ (МФ2-3) – 51,9%. Смертность в течение 5 лет при начальном МФ составляла 10,2%, в то время как при выраженном МФ – 39,7%. Некоторые авторы утверждают, что выраженный (коллагеновый) МФ является необратимым в отличие от начального (ретикулинового) МФ [22], что, вероятно, позволяет надеяться на разработку комбинированных средств лечения, направленных на коррекцию различных звеньев патогенеза гемобластозов. К таким лекарственным соединениям могут относиться как фибролитические агенты, так и модуляторы синтетической активности фибробластов.

Заключение

При ХМЛ в 24,5% случаев выявлялся начальный МФ, в 28% случаев – выраженный МФ; при ХЛЛ МФ наблюдался реже – в 13% случаев начальный, в 14% выраженный. Для ХМЛ характерно значительное увеличение содержания мегакариоцитов в костном мозге вне зависимости от наличия МФ (более чем в 30 раз по сравнению с группой сравнения без гематологических заболеваний), но в большей степени (в 50 раз) этот показатель был увеличен при выраженном МФ. В миелограммах больных ХМЛ появлялись карликовые мегакариоциты, содержание которых нарастало по мере увеличения степени выраженности и распространенности МФ. Параллельно увеличению содержания мегакариоцитов в костном мозге происходило увеличение тромбоцитов в периферической крови, наиболее значительно при выраженном МФ. При оценке гранулоцитарного звена гемопоэза при ХМЛ установлено увеличение содержания в костном мозге нейтрофильных (на 27%) и базофильных (в 7–8 раз) клеток, а также увеличение процентного содержания нейтрофилов (на 32–34%) и базофилов (в 4,5–4,8 раза) в периферической крови. Обнаружены прямые корреляционные связи между относительной площадью очагов начального и выраженного МФ и показателями мегакариоцитарно-тромбоцитарного и гранулоцитарного звеньев гемопоэза.

При ХЛЛ, наоборот, содержание мегакариоцитов в костном мозге и содержание тромбоцитов в периферической крови по мере нарастания выраженности МФ заметно снижалось (соответственно на 47% и в 2 раза). Подобная динамика изменений выявлена для гранулоцитарного звена гемопоэза: снижение процентного содержания нейтрофильных клеток в костном мозге в 2–3 раза по сравнению с группой сравнения без гематологических заболеваний и снижение содержания нейтрофилов в периферической крови в 2–3 раза. Обнаружены обратные корреляционные связи между выраженностью МФ и содержанием нейтрофилов в костном мозге и периферической крови.

Выявленные значительные количественные изменения в миелограммах и гемограммах при ХМЛ и ХЛЛ по мере нарастания выраженности и распространенности МФ до лечения свидетельствуют о важности оценки данного показателя костномозгового микроокружения для выбора комбинированных схем лечения и прогноза.

Таблица 2

Показатели гранулоцитарного звена гемопоэза при хроническом миелолейкозе и хроническом лимфолейкозе
при миелофиброзе различной выраженности (M±m)