В настоящее время в клинике при операциях на печени все чаще используется прием, сопровождающийся пережатием печеночно-дуоденальной связки, но сопровождающая данный процесс ишемия ткани печени вызывает выраженные изменения и/или нарушения функции данного органа. Повышение продолжительности ее пережатия более чем на десять минут уже может привести не только к выраженным деструктивным изменениям в ткани печени, но и оказывает пагубное влияние в целом на весь организм. Первоначально в условиях гипоксии печени ускоряются свободнорадикальные процессы и вызванное ими перекисное окисление липидов (ПОЛ) мембран клеток, это в свою очередь приводит к нарушению их проницаемости и выходу в периферический кровоток продуктов нарушенного метаболизма клеток. Некоторые из этих соединений (протеолитические ферменты, гликозаминогликаны, антипротеолитические белки, липопротеиды низкой и очень низкой плотности и протеогликаны) обладают довольно высокой иммуносупрессирующей активностью. Возрастание их концентрации приводит к возникновению достаточно выраженного вторичного иммунодефицита, который способствует присоединению в первую очередь «оппортунистической» инфекции, проявляющейся развитием, как правило, вторичных бактериальных госпитальных пневмоний, образованием абсцессов брюшной полости, нагноением послеоперационных ран, развитием флегмон забрюшинной клетчатки, что в итоге может вызвать развитие сепсиса и привести к неблагоприятному (летальному) исходу [1].
Эритроциты обладают огромными функциональными возможностями: транспорт О2 и СО2 гемоглобином, перенос за счет сорбционных свойств клеточной мембраны или в растворимой форме внутри билипидного матрикса аминокислот, нейромедиаторов, цитокинов иммунной системы, регуляция различных видов гомеостаза, гормонов, фармакологических препаратов, липидов, реологических свойств крови. В настоящее время выявлена важная роль эритроцитов в регуляции функции иммунокомпетентных клеток как в условиях нормы, так и при различных видах патологических состояний, в том числе и при заболеваниях гепатопанкреатобилиарной системы [1-3].
Известно, что введение аллогенных гепатоцитов (АГ), в большей степени культуральной жидкости АГ (КЖАГ) интактных доноров аллогенным реципиентам в модели экспериментальной острой ишемии печени (ОИП) предотвращает развитие в органе иммуновоспалительного синдрома, частично корригирует биохимические синдромы поражения гепатоцитов, процессы ПОЛ, корригирует нарушения врожденного и адаптивного иммунитетов [1; 4].
В связи с отсутствием достаточного количества работ, посвящённых изучению корригирующего влияния трансплантации ксено- и аллогенных клеток и продуктов их метаболизма в условиях ишемии печени [1; 5; 6], целью данного исследования стало определение корригирующих эффектов ксено- и аллогенных клеток печени при экспериментальном остром ишемическом поражении печени на представительность белков и липидов в мембране красных клеток крови.
Материалы и методы. Все лабораторные исследования проводились с соблюдением всех принципов Конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных работ (г. Страсбург, Франция, 1986) и соответствовали правилам лабораторной практики в Российской Федерации (Приказ МЗ РФ № 267 от 19.06.2003). В опытах использовано 128 половозрелых крыс-самцов серии Вистар массой 130-180 г. Дополнительно в качестве доноров гепатоцитов использовано 15 крысят серии Вистар и 25 белых мышат на 5-6 сутки после их рождения.
Экспериментальная ОИП вызывалась оперативным методом из верхнесрединного лапаротомного доступа под внутрибрюшинным гексеналовым наркозом (30 мг/кг веса), производилось пережатие гепатодуоденальной связки на протяжении 10 минут, далее рану обрабатывали 2% йодом и ушивали наглухо, послойно. Ложнооперированным животным проводили аналогичное оперативное вмешательство без пережатия гепатодуоденальной связки.
Выделение ксеногенных (мышиных) гепатоцитов (КГ) и АГ от животных на пятые-шестые сутки от момента рождения осуществлялось путем забора биоматериала печени, механического измельчения, клетки печени (гепатоциты) выделяли в среде 199 путем выдавливания. Затем полученную клеточную взвесь дважды отмывали центрифугированием на протяжении 10 мин при 400 g, разбавляли в среде 199 и подсчитывали с трипановым синим количество жизнеспособных клеток. В дальнейших опытах использовали суспензии, содержащие более 90% жизнеспособных клеток. После одновременно с моделированием ОИП пул суспензии клеток в концентрации 2 х 106 /кг вводили реципиентам внутрибрюшинно, пятикратно, через 24 часа, в объеме 0,5 мл в среде 199. Температура использованной среды 199 в течение всех манипуляций с клеточной взвесью составляла 36-37 °С [4].
С целью получения культуральной жидкости АГ (КЖАГ) клетки культивировали в среде 199 (5х107 клеток на 3 мл среды) в течение 4 ч, затем клетки печени осаждали центрифугированием в течение 15 мин при 400 g. Полученную КЖАГ вводили аллогенным реципиентам с ОИП из расчета 1 мг/кг белка пятикратно, внутрибрюшинно, с 24-часовым интервалом. АГ, КГ и КЖАГ готовили ежедневно и вводили реципиентам сразу же после приготовления [4].
В качестве препарата сравнения в работе использовано производное 3-гидроксипиридина - этилметилгидроксипиридина сукцинат (мексидол, ЗАО «АЛСИ Фарма», РФ). Препарат вводили в течение 5 дней, начиная с момента моделирования ОИП, внутрибрюшинно, через 24 часа, в дозе 50 мг/кг, которая была основана на рекомендациях «Регистра лекарственных средств России» (2010), инструкции по применению и результатах предыдущих исследований.
Все использованные экспериментальные животные были разделены на 6 групп (серий), в каждой из которых было по 11-12 особей:
– 1-я серия (контрольная) – здоровые животные;
– 2-я серия – животные с ОИП;
– 3-я серия – ОИП и введение мексидола;
– 4-я серия – ОИП и введение КГ;
– 5-я серия – ОИП и введение АГ;
– 6-я серия – ОИП и введение НЖАГ.
После моделирования ОИП показатель летальности у животных в 2-6 группах на протяжении пяти суток соответственно составил 34%, 26%, 21%, 17% и 16%. Выведение животных из эксперимента осуществляли через 24 часа после крайнего введения АГ, КГ или КЖАГ.
Статистическую обработку результатов проводили по общепринятым критериям вариационно-статистического анализа вычислением средних величин (M), ошибки средней арифметической (m). Существенность различий оценивали по U-критерию. Статистически значимыми считали различия с p < 0.05.
Результаты. Первоначально было выявлено, что ложная операция или введение интактным крысам мексидола, КГ, АГ и НЖАГ статистически не влияет у них на содержание белков и липидов в мембране эритроцитов. Развитие ОИП привело через 5 суток после моделирования к снижению в эритроцитарной мембране уровня α- и β-спектрина, анкирина, анионтранспортного белка (АТБ), паллидина, актина, глицеральальдегид-3-фосфатдегидрогеназы (Г-3-ФД) и глутатион-S-трансферазы (Г-S-Т), повышает уровень белка полосы 4.5, не влияя на представительность белка полосы 4.1, дематина и тропомиозина. Пятикратное введение после моделирования ОИП мексидола нормализует содержание Г-S-Т и корригирует, но не до показателей здоровых животных, уровень α- и β-спектрина, АТБ и актина. Применение КГ, по сравнению с мексидолом, дополнительно нормализует представительность в мембране эритроцитов белка полосы 4.5. Использование АГ, по сравнению с предыдущей группой, которая получала КГ, дополнительно нормализует содержание β-спектрина, паллидина и корригирует уровень анкирина, АТБ и Г-3-ФД. Наиболее эффективным оказалось введение КЖАГ, так как, по сравнению с АГ, дополнительно нормализовалась представительность α-спектрина, анкирина и паллидина (табл. 1).
Таблица 1
Влияние АГ, КГ и КЖАГ на содержание белков в мембранах эритроцитов при ОИП (M+m)
|
Показатели |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
|
Контроль |
ОИП |
|||||
|
- |
Введение мексидола |
Введение КГ |
Введение АГ |
Введение ЖАГ |
||
|
4.1 |
77.4±1.7 |
78.8±1.5 |
81.3±1.7 |
82.0±1.2 |
82.0±1.3 |
81.4±1.6 |
|
Анкирин |
64.2±1.1 |
45.1±1.1*1 |
44.3±1.9*1 |
41.2±1.4*1 |
51.3±1.0*1-4 |
67.7±1.6*2-5 |
|
Паллидин |
80.2±1.5 |
67.3±1.1*1 |
68.2±1.1*1 |
72.4±1.2*1 |
82.3±1.0*2-4 |
83.4±1.8*2-4 |
|
Дематин |
96.1±1.8 |
94.1±1.2 |
97.5±1.0 |
103.5±1.9 |
101.5±1.6 |
97.9±1.2 |
|
Г-3-ФД |
55.9±1.1 |
38.2±1.0*1 |
41.4±1.1*1 |
38.8±1.7*1 |
48.0±1.6*1-4 |
49.1±1.5 *1-4 |
|
АТБ |
123.3±1.5 |
91.3±1.7*1 |
97.4± 1.9*1.2 |
102.4±1.9*1.2 |
113.3±1.4*1-4 |
112.7±1.8*1-4 |
|
Тропомиозин |
65.1±1.1 |
68.5±1.4 |
65.3±1.1 |
67.7±1.8 |
64.0±1.1 |
62.8±1.2 |
|
4.5 |
118.5±1.4 |
133.5±1.9*1 |
132.5±1.8*1 |
118.5±1.5*2.3 |
118.8±1.8*2.3 |
118.8±1.3*2.3 |
|
β-спектрин |
98.0±1.3 |
81.1±1.5*1 |
86.9±1.0*1.2 |
87.1±1.2*1.2 |
97.1±1.0*2-4 |
101.1±1.3*2-4 |
|
Актин |
74.2±1.1 |
61.3±1.4*1 |
67.7±1.1*1.2 |
71.5±0.8*1.2 |
73.5±0.7*2 |
74.4±1.6*2 |
|
Г-S-Т |
69.9±1.1 |
61.3±1.1*1 |
68.8±1.3*2 |
73.3±1.4*2 |
71.9±1.9*2 |
72.5±1.0*2 |
|
α-спектрин |
105.3±1.1 |
92.3±1.2*1 |
98.0±1.1*1.2 |
98.7±1.1*1.2 |
96.2±1.0*1.2 |
106.4±1.4*2-5 |
Примечания: 1. Звездочкой отмечены достоверные отличия средних арифметических (p < 0.05). 2. Цифры рядом со звездочкой – по отношению к показателям какой группы даны отличия. 3. Единицы измерения показателей – мг%.
Установлено, что при ОИП в эритроцитарной мембране снижается уровень липидов внешнего (фосфатидилхолин - ФХ и сфингомиелин - СМ) и внутреннего слоя (фосфатидилэтаноламин - ФЭ и фосфатидилинозитол - ФИ) цитоплазматической мембраны эритроцитов. Установлено также уменьшение триацилглицеролов. Одновременно повышается содержание свободного холестерола (Х), эфиров холестерола (ЭХ), лизофосфатидилхолина (ЛФХ), неэтерифицированных жирных кислот (НЭЖК). Дополнительно определено снижение уровня глицерофосфолипидов (ГФЛ – сумма ФХ, ФЭ, ЛФХ, ФИ и ФС), фосфолипидов (ФЛ – сумма СМ и ГФЛ), при нормальном уровне фосфатидилсерина (ФС), суммы моно- и диацилглицеролов (МАГ, ДАГ). Применение мексидола нормализует уровень ФИ, приближает к показателям здоровых животных содержание ФХ, ЛФХ, СМ, ТАГ и НЭЖК. Использование КГ, по сравнению с мексидолом, дополнительно корригирует уровень ФЭ, ГФЛ, СМ и ФЛ. Введение АГ, по сравнению с предыдущей группой экспериментальных животных, дополнительно нормализует представительность ФХ, ГФЛ, ФЭ, ФЛ и корригирует уровень СМ и ЛФХ. Введение КЖАГ, как и в отношении белков мембраны, также оказалось наиболее эффективным, так как, по сравнению с АГ, дополнительно нормализовало содержание ЛФХ, СМ, НЭЖК и корригировало представительность Х и ТАГ (табл. 2).
Таблица 2
Влияние АГ, КГ и КЖАГ на содержание липидов в мембранах эритроцитов при ОИП (M+m)
|
Показатели |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
|
Контроль |
ОИП |
|||||
|
- |
Введение мексидола |
Введение КГ |
Введение АГ |
Введение КЖАГ |
||
|
ФИ |
3.8±0.2 |
3.4±0.1*1 |
3.5±0.2 |
3.6±0.3 |
3.9±0.3 |
3.9±0.4 |
|
ФЛ |
89.6±2.0 |
77.7±0.3*1 |
79.8±0.2*1 |
84.1±0.3*1-3 |
89.2±0.8*2-4 |
90.7±2.1*2-4 |
|
ГФЛ |
76.9±1.9 |
69.6±0.0*1 |
70.4±0.6*1 |
73.7±0.4*1-3 |
77.9±0.7*2-4 |
78.0±1.9*2-4 |
|
ФХ |
23.7±0.5 |
18.4±0.2*1 |
20.2±0.4*1.2 |
21.0±0.2*1.2 |
23.3±0.4*2-4 |
23.8±0.3*2-4 |
|
ФС |
22.2±1.3 |
21.2±0.8 |
20.3±0.7 |
20.5±0.6 |
22.2±0.2 |
22.7±1.9 |
|
ЭХ |
37.5±1.1 |
43.1±0.1*1 |
41.2±0.5*1 |
42.9±0.7*1 |
40.8±0.5*1 |
41.4±2.1*1 |
|
СМ |
12.7±0.4 |
8.1±0.5*1 |
9.4±0.4*1,2 |
10.4±0.2*1-3 |
11.3±0.5*1-4 |
12.8±0.7*2-5 |
|
ФЭ |
22.0±1.3 |
18.0±0.3*1 |
18.7±0.2*1 |
20.8±0.4*1-3 |
22.4±0.4*2-4 |
22.5±0.9*2-4 |
|
Х |
41.1±1.7 |
51.1±0.3*1 |
48.3±0.5*1 |
48.4±0.3*1 |
47.6±0.0*1 |
44.0±1.2*1-5 |
|
ТАГ |
15.2±1.6 |
9.4±0.8*1 |
11.4±0.6*1.2 |
12.4±0.3*1.2 |
12.2±0.6*1.2 |
13.9±0.7*1-5 |
|
ЛФХ |
5.2±0.08 |
8.6±0.2*1 |
7.7±0.3*1.2 |
7.8±0.4*1.2 |
6.1±0.1*1-4 |
5.1±0.07*2-5 |
|
НЭЖК |
3.4±0.5 |
5.2±0.3*1 |
4.2±0.2*1.2 |
4.3±0.4*1.2 |
4.1±0.2*1.2 |
3.6±0.3*2-5 |
|
ДАГ+МАГ |
9.2±0.4 |
8.9±0.4 |
9.4±0.6 |
10.3±0.2 |
9.9±0.7 |
9.7±0.8 |
|
Соотношение фракций липидов |
||||||
|
СМ/ФХ |
0.54±0.03 |
0.44±0.02*1 |
0.4±0.02*1 |
0.5±0.02*1-3 |
0.56±0.02*2-4 |
0.54±0.01*2-4 |
|
ФХ+СМ/ФЭ+ФС+ФИ |
0.76±0.02 |
0.62±0.03*1 |
0.7±0.02*1.2 |
0.7±0.02*1.2 |
0.71±0.03*2 |
0.75±0.02*2-4 |
|
СМ/ГФЛ |
0.17±0.01 |
0.12±0.01*1 |
0.13±0.02*1 |
0.14±0.02 |
0.15±0.02 |
0.16±0.03 |
|
Х+ЭХ/ФЛ |
0.88±0.03 |
1.21±0.04*1 |
1.12±0.04*1.2 |
1.1±0.03*1.2 |
0.99±0.03*1-4 |
0.94±0.04*1-4 |
|
ЛФХ/ФХ |
0.22±0.01 |
0.47±0.03*1 |
0.38±0.02*1.2 |
0.37±0.02*1.2 |
0.26±0.01*1-4 |
0.21±0.02*2-5 |
Примечания: 1. Звездочкой отмечены достоверные отличия средних арифметических (p < 0.05). 2. Цифры рядом со звездочкой – по отношению к показателям какой группы даны отличия. 3. Единицы измерения показателей – мг.
У животных с ОИП оказалось повышенным отношение Х+ЭХ/ФЛ, ЛФХ/ФХ и сниженным соотношение СМ/ФХ, ФХ+СМ/ФЭ+ФС+ФИ и СМ/ГФЛ. Введение мексидола корригировало, но не до значений контроля, отношение ЛФХ/ФХ, ФХ+СМ/ФЭ+ФС+ФИ и Х+ЭХ/ФЛ. Использование КГ дополнительно нормализует соотношение СМ/ГФЛ и корригирует СМ/ФХ. Применение АГ, по сравнению с КГ, дополнительно нормализует отношение СМ/ФХ, ФХ+СМ/ФЭ+ФС+ФИ и в еще большей степени приближает к значениям здоровых животных соотношение ЛФХ/ФХ и Х+ЭХ/ФЛ. В дополнение к показателям предыдущей группы введение КЖАГ нормализует отношение ЛФХ/ФХ (табл. 2).
Анализируя полученные данные, можно констатировать, что в условиях ОИП от значений здоровых животных 83.3% параметров белково-липидного спектра мембраны эритроцитов оказались измененными, что коснулось интегральных белков, ответственных за внутриклеточный метаболизм красных кровяных клеток (АТБ, Г-3-ФД, Г-S-Т, белок полосы 4.5) и периферических белков, ответственных за стабилизацию, структурообразование мембраны (анкирин, паллидин, α- и β-спектрин), формообразование и гибкость мембраны (актин). Снижение содержания мембранных глицеро- и сфингофосфолипидов, составляющих каркас клеточной мембраны и упорядочивающих белковые и гликосфинголипидные ее составные части, изменение фосфолипидов, локализующихся преимущественно на наружной поверхности цитоплазматической мембраны (ФХ+СМ) к фосфолипидам ее внутренней части (ФС+ФЭ+ФИ), повышение ЛФХ/ФХ (фактор модификации свойств липидного бислоя и интегральных мембранных белков), повышение содержания Х, ЭХ, соотношения Х+ЭХ/ФЛ, нарушающее функцию рецепторов и ферментов мембраны, наряду со структурными изменениями белков, являющихся в большей части ферментами, переносчиками и рецепторами, приводят к нарушениям внутриклеточного метаболизма и функциональных свойств красных кровяных клеток циркулирующей крови [2; 4].
Введение препарата сравнения мексидола нормализовало 8.0% измененных как следствие ОИП показателей белково-липидного спектра мембраны эритроцитов, корригировало, но не до контрольных значений, 48.0%, а 44.0% параметров остались без изменения. Применение КГ соответственно нормализовало и корригировало 20.0% и 60.0% показателей, не влияя на 20.0% параметров. Введение АГ нормализовало 52.0%, корригировало 40.0% и не влияло на 8% измененных показателей. Наиболее эффективным оказалось применение КЖАГ, т.к. её введение при ОИП нормализовало 76.0%, корригировало 20.0%, не влияя на 4.0% параметров эритроцитарной мембраны.
Обсуждение. Все клетки животного происхождения, не исключение и красные клетки крови, в цитоплазматических мембранах содержат внутренний и внешний слои фосфолипидов, при этом распределение их отдельных представителей в мембране асимметрично. За счет этого происходит взаимодействие регуляторных и структурных белков, поддерживаются механические свойства мембраны и форма клетки, большая текучесть внутреннего монослоя [2; 7; 8-10].
В ранее проведенных опытах выявлено, что введение аллогенных или ксеногенных гепатоцитов, а еще более применение культуральной жидкости последних животным с ОИП нивелирует выраженность процессов свободнорадикального окисления, активность системной воспалительной реакции в отношении показателей врожденного иммунитета, оказывает выраженное корригирующее влияние на восстановление функциональной активности клеток печени и метаболизма внутри эритроцитов [4].
Выводы. Эффекты и механизмы действия трансплантируемых гепатоцитов, выявляемые при их введении, связаны не столько с их органозамещающей функцией, сколько с нормализацией и активацией аутологичных клеток печени через выделение КГ и АГ (что подтверждается положительными эффектами вводимой КЖАГ) гуморальных соединений (пептидов, факторов роста, цитокинов и др.), изменяющих количественно и качественно состав сыворотки циркулирующей крови и через это содержание и соотношение белков и липидов мембраны эритроцитов.