Показатели поглотительной и метаболической активности фагоцитов, по которым можно судить не только об иммунологической реактивности организма, но и степени влияния различных внешних и внутренних факторов, наиболее точно отражают функциональное состояние иммунитета [1]. Важным показателем естественной неспецифической реактивности организма является функциональное состояние клеток, ответственных за процесс фагоцитоза и внутриклеточное переваривание инфекционных агентов [2]. В связи с этим большое значение имеет исследование поглотительной и метаболической активности фагоцитов с помощью реакции с нитросиним тетразолием, имеющей общие закономерности с процессом фагоцитоза и раскрывающей его биохимические основы.
Биохимическим маркером активности пероксидазных систем является активация стимулированных фагоцитирующих клеток с восстановлением нитросинего тетразолия (НСТ-тест), которая основана на поглощении фагоцитами нитросинего тетразолия из среды с его последующим восстановлением. По результатам НСТ-теста можно судить о функциональной активности ферментной системы фагоцитов и энзиматических дефектах клеточного иммунитета [3, 4].
Данные литературы [5–8] позволяют предположить, что глюконаты 3d-металлов оказывают иммуномодулирующее действие, связанное с возможностью активации фагоцитоза остатками глюконовой кислоты аналогично подобной активации, описанной для молекул полисахаридов, например для 1,3-гликанов [9], что и обусловило цель данного исследования: оценка влияния соединений 3d-металлов с глюконовой кислотой на поглотительную и метаболическую активность фагоцитов крови лабораторных мышей с индуцированным иммунодефицитом.
Материалы и методы исследования. Глюконаты 3d-металлов (3dMeGl), где Me: Mn/Fe/Co/Cu/Zn (II), были синтезированы в Уфимском институте химии УфИЦ РАН по методике И.Г. Конкина с соавт. [10]. Физико-химические свойства данных соединений изучены методами инфракрасной и электронной спектроскопии, термического разложения, молярной электропроводности, измерения эффективных магнитных моментов [10].
Эксперимент проводили в течение двух недель на белых беспородных лабораторных мышах, содержащихся в условиях вивария ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России на стандартном питании (ГОСТ Р50258-92) в соответствии с Международными рекомендациями Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1997 г.), а также с правилами лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ З 51000.3-96, ГОСТ З 51000.4-96).
Для решения поставленных задач животные были разбиты на 9 экспериментальных групп (по 12 особей) из белых половозрелых мышей – самцов (25–30 г): 1-ая группа – интактные и 2–9-я группы – с иммунодефицитом, индуцированным путем однократного внутрибрюшинного введения циклофосфамида («Бакстер АГ», Швейцария) в дозе 50 мг/кг.
В качестве препаратов сравнения использовали иммуностимулирующий препарат Ликопид® (АО «Пептек», Россия; действующее вещество – глюкозаминилмурамилдипептид) и глюконат кальция (Обновление ПФК, Россия). Все препараты разводили в дистиллированной воде и вводили ежедневно по 0,2 мл перорально через сутки после инъецирования циклофосфамида, в рассчитанных дозировках: ликопид – 0,025 мг/мл согласно инструкции (0,14–0,28 мг/кг), глюконат кальция и 3dMeGl – в концентрации 10-2 моль/л. Мыши первых двух групп получали дистиллированную воду в том же объеме.
На 16-е сутки мышей под эфирным наркозом выводили из эксперимента в соответствии c Пoлoжeниeм о гуманном отношении к живoтным (МЗ РФ oт 19 июня 2003 г. № 267) и отбирали кровь, которую cтaбилизирoвaли гeпaринoм. Оценивали следующие показатели функциональной активности фагоцитов: фагоцитарное число (ФЧ), фагоцитарный индекс (ФИ) и интегральный фагоцитарный индекс (ИФИ). Метаболическую активность клеток оценивали в сравнительном двухвариантном НСТ-тесте (спонтанный/индуцированный) по проценту лейкоцитов с гранулами восстановленного НСТ (диформазан черного цвета), по среднему цитохимическому коэффициенту (СЦК) и индексу стимуляции (ИС) [1].
При статистической обработке данных рассчитывали медиану (Ме) и интерквартильный размах (Q1–Q3), используя программы «Microsoft Excel» и «Statistica 10,0». Статистическую значимость различий между показателями оценивали по критерию Манна–Уитни. Отличия статистически значимыми считали при p<0,05.
Результаты и их обсуждение
Результаты исследования представлены в таблице 1. При сравнении фагоцитарной активности фагоцитов первой контрольной группы мышей «контроль-интактные» (№ 1) и мышей второй группы с моделированным иммунодефицитом (№ 2) отчетливо видна разница между показателями: ФЧ статистически значимо снижался на 57,4%, ФИ – на 23,8%, ИФИ – на 67,6% (p<0,05). Метаболическая активность клеток в этой группе мышей также снижалась относительно показателей интактных мышей. Так, значения НСТ–СП (%) становились ниже на 34,6%, НСТ–ИН (%) – на 29,6%; показатели цитохимических коэффициентов СЦК–СП (у.е.) – на 35,5%, СЦК–ИН (у.е.) – на 25,7% (p<0,05).
Влияние глюконатов 3d-металлов на поглотительную и метаболическую активность фагоцитов крови мышей
с индуцированным путем внутрибрюшинного введения циклофосфамида иммунодефицитом (ИД)
|
Показатель |
Группы мышей |
||||||||
|
1 (n=12) |
2 (n=12) |
3 (n=12) |
4 (n=12) |
5 (n=12) |
6 (n=12) |
7 (n=12) |
8 (n=12) |
9 (n=12) |
|
|
Контроль-интактные |
ИД б/лечения |
ИД+ Ликопид |
ИД+ СaGl2 |
ИД+ MnGl |
ИД+ FeGl |
ИД+ CoGl |
ИД+ CuGl |
ИД+ ZnGl |
|
|
Фагоцитарное число (ФЧ) |
|||||||||
|
Ме [Q1–Q3] p-знач. |
5,4 [5,3–5,5] |
2,3 [2,03–2,6] р1-2= 0,00003 |
3,8 [3,5–4,1] р2-3= 0,00003 |
2,6 [2,2–2,9] р2-4= 0,112 |
4,3 [3,9–4,6] р2-5= 0,00003 р3-5= 0,008 р4-5= 0,00003 |
3,3 [2,9–3,6] р2-6= 0,00006 р3-6= 0,009 р4-6= 0,0003 |
3,4 [3,2–3,6] р2-7= 0,00003 р3-7= 0,008 р4-7= 0,00003 |
4,0 [3,9–4,1] р2-8= 0,00003 р3-8=0,37 р4-8= 0,00003 |
4,0 [3,8–4,2] р2-9= 0,00003 р3-9= 0,18 р4-9= 0,00003 |
|
Фагоцитарный индекс (ФИ) |
|||||||||
|
Ме [Q1–Q3] p-знач |
68,8 [63,7–72,6] |
52,4 [48,3–55,6] р1-2= 0,00003 |
57,06 [52,2–61,9] p2-3=0,049 |
51,9 [48,7–54,2] р2-4= 0,641 |
65,7 [63,7–67,2] p2-5= 0,00003 р3-5= 0,00006 р4-5=0,0003 |
53,3 [50,9–55,2] p2-6=0,603 р3-6=0,119 р4-6=0,157 |
52,8 [50,1–56,8] p2-7=0,386 р3-7=0,08 р4-7= 0,00003 |
56,9 [54,1–59,2] p2-8=0,009 р3-8=0,908 р4-8= 0,0014 |
62,3 [58,9–64,9] p2-9= 0,00006 р3-9= 0,021 р4-9=0,0003 |
|
Интегральный фагоцитирующий индекс (ИФИ) |
|||||||||
|
Ме [Q1–Q3] p-знач |
3,7 [3,4–3,9] |
1,2 [1,03–1,3] р1-2= 0,00003 |
2,1 [1,9–2,3] p2-3= 0,00003 |
1,3 [1,02–1,5] p2-4= 0,273
|
2,8 [2,5–3,1] p2-5=0,00003 р3-5=0,0001 р4-5=0,0003 |
1,7 [1,5–1,9] р2-6=0,0001 р3-6=0,008 р4-6=0,002 |
1,8 [1,6–1,9] р2-7=0,0000 р3-7=0,01 р4-7=0,0005 |
2,3 [2,08–2,4] р2-8=0,00003 Р3-8=0,18 р4-8=0,00003 |
2,5 [2,2–2,7] р2-9=0,00003 р3-9=0,018 р4-9=0,00003 |
|
НСТ-СП (%) |
|||||||||
|
Ме [Q1–Q3] p-знач
|
7,8 [6,5–8,9]
|
5,1 [4,3–5,8] р1-2=0,0001 |
6,7 [5,7–7,6] р2-3=0,002 |
5,3 [4,3–6,1] р2-4=0,47 |
7,3 [6,3–8,1] р2-5=0,0001 р3-5=0,184 р4-5=0,0005 |
5,7 [5,1–6,1] р2-6=0,046 р3-6=0,024 р4-6=0,34 |
6,0 [5,1–6,6] р2-7=0,037 р3-7=0,184 р4-7=0,064 |
7,2 [6,7– 7,7] р2-8= 0,00003 р3-8=0,26 р4-8=0,0005 |
6,7 [5,7–7,6] р2-9= 0,002 р3-9=1,0 р4-9=0,009 |
|
НСТ–ИН (%) |
|||||||||
|
Ме [Q1–Q3] p-знач |
60,9 [54,5–65,9] |
42,9 [33,0–51,5] р1-2= 0,0002 |
54,1 [51,7–57,8] Р2-3=0,002
|
44,9 [38,8–49,5] р2-4=0,77
|
56,9 [53,1–59,9] р2-5=0,0003 р3-5=0,119 р4-5=0,0001 |
52,5 [50,7–53,8] р2-6=0,009 р3-6=0,17 р4-6=0,002 |
50,1 [47,5–52,1] р2-7= 0,012 Р3-7=0,007 р4-7=0,015 |
56,9 [52,2–60,4] р2-8= 0,0005 Р3-8=0,194 р4-8=0,0001 |
55,4 [52,7–57,5] р2-9= 0,0004 Р3-9=0,603 р4-9=0,00006 |
|
СЦК-СП (у.е.) |
|||||||||
|
Ме [Q1–Q3] p-знач |
0,31 [0,27–0,34] |
0,2 [0,17–0,22] р1-2=0,0004 |
0,33 [0,3–0,35] р2-3=0,00003 |
0,23 [0,22–0,24] р2-4=0,113
|
0,31 [0,28–0,33] р2-5=0,0003 р3-5=0,14 р4-5=0,0002
|
0,32 [0,29–0,34] р2-6=0,0003 р3-6=0,312 р4-6=0,0004 |
0,34 [0,32–0,35] р2-7= 0,00003 р3-7=0,312 р4-7=0,01 р1-7=004 |
0,31 [0,28–0,33] р2-8= 0,00003 р3-8=0,141 р4-8=0,0002 |
0,32 [0,29–0,34] р2-9= 0,00007 р3-9=0,312 р4-9=0,0004 |
|
СЦК-ИН (у.е.) |
|||||||||
|
Ме [Q1–Q3] p-знач |
0,7 [0,65–0,74] |
0,52 [0,46–0,58] р1-2=0,00003 |
0,65 [0,61–0,68] p2-3=0,0001 |
0,52 [0,48–0,55] р2-4=0,82
|
0,69 [0,64–0,74] р2-5=0,0001 р3-5=0,09 р4-5=0,0003 |
0,63 [0,58–0,67] р2-6=0,001 р3-6=0,27 р4-6=0,0001 |
0,64 [0,58–0,7] р2-7=0,002 р3-7=0,82 р4-7=0,0004 |
0,68 [0,63–0,72] р2-8=0,0001 р3-8=0,13 р4-8=0,0003 |
0,67 [0,65–0,69] р2-9=0,0003 р3-9=0,26 р4-9=0,0003 |
|
Индекс стимуляции (ИС) |
|||||||||
|
Ме [Q1–Q3] p-знач |
2,4 [1,9–2,7] |
1,3 [1,2–1,4] р1-2= 0,00009
|
2,0 [1,8–2,2] p2-3= 0,00003 |
1,5 [1,4–1,6] р2-4= 0,005
|
2,2 [1,9–2,6] р2-5= 0,00006 р3-5=0,204 р4-5=0,0002 |
2,0 [1,7–2,3] р2-6=0,0001 р3-6=0, 33 р4-6=0,0003 |
2,1 [1,7–2,06] р2-7= 0,0001 р3-7=0,47 р4-7=0,002 |
2,3 [2,03–2,6] р2-8= 0,00003 р3-8=0,045 р4-8=0,00003 |
2,1 [1,9–2,3] р2-9= 0,00003 р3-9=0,193 р4-9=0,00003 |
Примечание: ИД – индуцированный иммунодефицит; р2-n <0,05 – статистически значимые отличия по сравнению с группой «ИД б/лечения» и р3-n / р4-n <0,05 - статистически значимые отличия по сравнению с группами сравнения: «ИД + Ликопид» и «ИД + СaGl2»
Показатель ИС, отражающий интенсивность энергетических процессов ферментных систем фагоцитирующих клеток, снижался на 45,8% (p<0,05).
Таким образом, представленные результаты свидетельствуют о том, что состояние мышей, вызванное инъецированием циклофосфамида, можно отнести ко вторично иммунодефицитному [1].
После двухнедельной терапии препаратом Ликопид была показана статистически значимая активация фагоцитоза: ФЧ – 27,7%, ФИ – 6,8%, ИФИ – 24,3%, НСТ–СП (%) – 20,5%, НСТ–ИН (%) – 18,4%, СЦК–СП (у.е.) – 41,9%, СЦК–ИН (у.е.) –18,5%; ИС (у.е.) увеличивался на 29,1% (p<0,05) по сравнению с показателями иммуносупрессированных животных, не получавших лечения. Проведение иммунодефицитным мышам терапии глюконатами 3d-металлов привело к значимой, сопоставимой с действием ликопида, активации фагоцитоза. Было показано, что наибольшее увеличение ФЧ наблюдалось в группе животных, получавших MnGl, – на 37%, что на 9,3% превысило действие ликопида (p<0,05). Под действием ZnGl и CuGl данный показатель увеличивался на 31,5% (отличия с действием ликопида статистически не значимы). Введение FeGl и CoGl вызывало повышение ФЧ на 18,5 и 20,4% по сравнению с иммунодефицитными мышами без лечения, что оказалось менее эффективным относительно эффекта ликопида (p<0,05). ФИ под действием 3dMeGl также повышался: в случае MnGl на 19,3%, ZnGl – на 14,4%, CuGl – на 6,5%. При этом ИФИ под действием MnGl увеличивался на 43,3%, ZnGl – на 35,2%, CuGl – на 29,8%, CoGl – на 16,2% и FeGl – на 13,5% (p<0,05). Рост показателя НСТ–СП (%) по сравнению с группой иммуносупрессированных мышей составил 28,2% после терапии MnGl, 26,9% – CuGl, 20,5% – ZnGl, 7,7% – FeGl. НСТ–ИН (%): на 16,2% CoGl, 23% – MnGl и CuGl, 20,5% – ZnGl, 15,8% – FeGl и 11,9% – CoGl (p<0,05). Повышение цитохимических коэффициентов, а именно СЦК–СП (у.е.), происходило практически до уровня интактных мышей, при этом разница с группой «ИД без лечения» составляла после терапии CoGl – 45,2%, ZnGl – 38,7%, MnGl, FeGl и CuGl – 35,5%. Как видно, максимальная разница обнаруживалась после терапии CoGl, после его введения наблюдалось даже превышение уровня интактных животных на 9,7% (p<0,5). Показатели СЦК–ИН (у.е.) соответственно возрастали на 24,3% после терапии MnGl, на 22,8% – CuGl, на 21,4 – ZnGl, на 17,1 – CoGl и 15,7 – FeGl по сравнению с показателями иммуносупрессированных животных, не получавших лечения. Информативным в отношении фагоцитирующих клеток биоцидности считается показатель индекса стимуляции (ИС), рассчитываемый по показателям среднего цитохимического коэффициента, который отображает интенсивность энергетических процессов ферментных систем фагоцитирующих клеток [9]. Данный показатель значительно возрастал следующим образом: после введения CuGl – на 41,6% и далее в порядке уменьшения: MnGl – на 37,5%, ZnGl – на 33,3%, FeGl и CoGl – на 29,1% (так же как и после введения ликопида) (p<0,05).
Заключение. Полученные результаты свидетельствуют об иммунокорригирующих свойствах глюконатов 3d-металлов, которые восстанавливают метаболическую систему фагоцитоза. Неизменность или незначительный рост фагоцитарной активности под действием CaGl подтверждают ведущую роль в иммунокоррекции 3d-металлов, отвергая при этом участие в активации фагоцитоза остатков глюконовой кислоты.