Наряду с другими тяжелыми металлами никель влияет на аллергические мутагенные показатели, индуцирует процессы липопероксидации и способствует развитию онкопатологий [1]. На молекулярном уровне никель повышает уровень активных метаболитов кислорода (АМК), нарушая окислительно-восстановительные реакции в клетках [2; 3].
В условиях окислительного стресса развивается эндотелиальная дисфункция, патогенетическим звеном которой является уменьшение концентрации NО-вазодилатирующего фактора и снижение уровня биодоступности оксида азота. Современные данные литературы в эксперименте и клинике подтверждают ключевую роль дисфункции эндотелия в развитии сосудистых осложнений при различных нозологиях [4].
Для нарушения функции эндотелия характерно изменение взаимодействия между вазодилататорами и вазоконстрикторами с преобладанием последних. Следует отметить, что оксид азота обладает сосудорасширяющими свойствами, а еще оказывает мембранотропное, антипролиферативное, антитромботическое действия. Как правило, угнетение NO-продуцирующей функции эндотелия развивается в условиях нарушения окислительно-восстановительных процессов, которые имеют место на фоне действия тяжелых металлов, и может индуцироваться ингибитором экспрессии eNOS – L-NAME.
Субстратом для образования оксида азота является L-аргинин - полунезаменимая аминокислота, которая используется во многих метаболических процессах, включая синтез мочевины. Поэтому актуальным является исследование взаимодействия между ингибиторами фермента аргиназы и индукторами, и блокаторами экспрессии eNOS в процессе образования оксида азота. Данные экспериментальных исследований о влиянии L-аргинина на образование NO в системе кровообращения при заболеваниях сердца свидетельствуют о восстановлении синтеза NO и сосудистой функции при сердечно-сосудистых заболеваниях [5; 6].
Участие L-аргинина в процессе образования NO подтверждается наличием его дефицита при генетически детерминированных заболеваниях [7]. Роль аргиназы в регуляции доступности L-аргинина также подтверждают генетические исследования. Нокаут гена у мышей, определяющий образование аргиназы I, не оказывает влияние на их жизнеспособность. Отмечается нулевое содержанием аргиназы II и примерно двукратное увеличение в плазме концентрации L-аргинина. Предположительно в определении содержания L-аргинина в крови оказывают влияние аргиназа I и II, которые осуществляют разные биологические действия [7]. Исследуется причинность сниженной доступности L-аргинина. Аргиназа – металлофермент, имеет две изоформы: аргиназа-I, характерная для печеночной, почечной тканей, однако работает и в предстательной железе, и в ГМК аорты, нормализует угнетение аргиназы или вспомогательную подачу оксида азота и сосудорасширяющую функцию после ишемии-реперфузии. При метаболическом синдроме повышает функциональную гипергликемию и способствует эндотелиальной дисфункции. Степень образования аргиназы II стимулируется продуктами липопероксидации. Это связано с тем, что реагирующие элементы находятся в промоторной области аргиназы II [7].
Данные литературы свидетельствуют о том, что торможение аргиназы приводит к увеличению синтеза NO в эндотелиальных клетках. Очень важен факт, что существенная экспрессия аргиназы в эндотелиальных клетках (ЭК) микрососудов противодействует NO-опосредованной дилатации.
Таким образом, в лечении дисфункции эндотелия при различных патологиях аргиназа является точкой приложения фармакологических препаратов.
Все вышеизложенное свидетельствует о том, что перспективным путем терапии эндотелиальной дисфункции является разработка способа коррекции, основанного на изучении взаимодействия между индуктором eNOS – L-аргинином и ингибитором аргиназы – L-норвалином.
Целью настоящего исследования является исследование состояния системы ПОЛ – АОС, содержания NOx на модели дисфункции эндотелия, вызванной никелевой интоксикацией, и разработка нового способа коррекции дефицита оксида азота L-аргинином, L-норвалином и их комбинацией.
Материал и методы исследования. Эксперимент проводили на крысах «Вистар» одинакового возраста. Животных содержали в виварии по «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных» и принципам Хельсинкской декларации.
Моделировали никелевую интоксикацию парентеральным введением хлорида никеля в течение 1 месяца в дозе 0,5 мг/ кг веса животного. Вводимая доза хлорида никеля была выбрана методом титрования, начиная от DL50 до биологически значимой, не вызывающей гибели животных. Подопытные крысы разделялись по группам:
1) интактные крысы;
2) крысы с Ni интоксикацией без лечения;
3) крысы с Ni интоксикацией + L-аргинин (10 мг/кг, 30 дней); крысы с Ni интоксикацией + L-норвалин (10 мг/кг, 30 дней);
4) крысы с Ni интоксикацией + L-аргинин + L-норвалин (30 дней).
Выбор доз вводимых препаратов основывался на данных литературы – общепринятых и широко используемых. По завершении в гемолизате эритроцитов определяли концентрацию малонового диальдегида (МДА) [9]. Состояние АО системы судили по активности СОД [10]. Активность каталазы [11], концентрацию церулоплазмина [12] и концентрацию суммарных метаболитов оксида азота (NOх) [13] определяли в сыворотке крови.
С помощью программы Microsoft Excel 2006 проводили статобработку результатов, представленных в виде среднего значения (Mean) и ошибки среднего (SEM). Статистическую достоверность различий проверяли t-критерием Стьюдента, р<0,05 считали уровнем статистической значимости. Провели корреляционный анализ.
Результаты исследования и их обсуждение
У интоксифицированных хлоридом никеля крыс повышается активность ПОЛ и увеличивается содержание вторичного продукта МДА в крови. Прямую корреляционную связь (r=+0,57, р<0,001) показало исследование взаимосвязей между активностью ПОЛ в эритроцитах и концентрацией никеля в плазме крови на фоне экспозиции хлоридом никеля в течение месяца. Интенсивность процессов СРО ограничивает АОС организма: СОД, каталаза и ЦП. Поэтому мы определяли активность СОД в эритроцитах, а каталазы и ЦП в сыворотке крови. Активация липопероксидации обусловлена снижением активности СОД в эритроцитах у подопытных крыс с никелевой интоксикацией. Что касается каталазы, то происходит возрастание ее функциональной способности наряду с ЦП. Развивается окислительный стресс, который сопровождается снижением концентрации суммарных метаболитов NO. Наличие сильной отрицательной связи между увеличением МДА и снижением NOx в крови (r=-0.72) выявил корреляционный анализ. Нехватка L-аргинина, наличие ингибитора eNOS, снижение уровня экспрессии нитрооксидсинтазы, доступности NO и участие L-аргинина в орнитиновом цикле – основные причины нарушения гомеостаза оксида азота. При систематической интоксикации хлоридом Ni впервые установлена активация окислительно-восстановительных процессов, сопровождающаяся понижением содержания NOх. Эти изменения содержания NO происходили на фоне достоверного повышения в эритроцитах концентрации МДА – вторичного продукта липопероксидации (таблица).
Биохимические показатели крови при затравке хлоридом никеля у крыс
|
|
Контроль |
NiCl2 |
NiCl2 + L-аргинин |
NiCl2 + L-аргинин+ L-норвалин |
|
МДА, эритроциты, нмоль/мл |
4,41±0,06 |
5,49±0,0491111) |
5,27±0,0312222) |
4,95±0,0453333) 4444) 5555) |
|
СОД, эритроциты, ед. акт. |
88,86±1,26 |
57,8±1,191111) |
60,3±0,312) |
64,80±1,293333) 444) 5555) |
|
Каталаза, сыворотка крови, мкат/л |
227,84±3,98 |
318,76±3,231111) |
310,05±2,672) |
271±2,153333) 4444) 5555) |
|
Церулоплазмин, сыворотка крови, мг/л |
343,86±7,14 |
401,4±1,271111) |
390,1±4,4822) |
367,8±3,453333) 4444) 555) |
|
NOх, сыворотка крови, мкМ |
50,93±0,63 |
34,53±0,391111) |
40,13±0,132222) |
45,1±0,523333) 4444) 5555) |
Примечания: 1111) - p<0,001; 111) - p<0,01; 11) - p<0,02; 1) - p<0,05 достоверность хлорид никеля относительно контроля;
2222) - p<0,001; 222) - p<0,01; 22) - p<0,02; 2) - p<0,05 достоверность хлорид никеля относительно NiCl2 + L-аргинин;
3333) - p<0,001; 333) - p<0,01; 33) - p<0,02; 3) - p<0,05 достоверность хлорид никеля относительно NiCl2 + L-аргинин+ L-норвалин;
4444) - p<0,001; 444) - p<0,01; 44) - p<0,02; 4) - p<0,05 достоверность NiCl2 + L-аргинин относительно NiCl2 + L-аргинин+ L-норвалин;
5555) - p<0,001; 555) - p<0,01; 55) - p<0,02; 5) - p<0,05 достоверность контроль относительно NiCl2 + L-аргинин+ L-норвалин.
Корреляционный анализ показал, что содержание NOх зависит от интенсивности СРО и увеличения содержания МДА. Уровень NOх в этих условиях зависит от следующих факторов:
1) его реакции с супероксиданион-радикалом (О2-) с продуктом окисления, который называется пероксинитрит;
2) окислительного влияния супероксиданион-радикала О2- на ТГБП эндотелиальной NO-синтазы (еNOS);
3) угнетения уровня воспроизведения NOS-3 и нарушения тканевой функции энзима.
Ведущую роль в развитии дефицита NO и дисфункции эндотелия играет концентрация L-аргинина. В нормальных физиологических условиях его содержание составляет 45-150 мкмоль/л. Это зависит от различных причин и может варьировать. Доставка L-аргинина в эндотелиальные клетки зависит от состояния у-транспортера, связанного с мембраной клетки, и активности ферментов цикла синтеза мочевины, в частности аргиназы. По данным ряда авторов следует отметить, что во внутренней выстилке сосуда происходит реакция превращения L-аргинина в NG-гидрокси-L-аргинин, и эта реакция ускоряется ферментом нитрооксидсинтазой [14]. Чем интенсивнее работает NO-синтаза, тем сильнее происходит выработка оксида азота, что предотвращает понижение его образования.
Возможность использования L-аргинина энзимом синтазой оксида азота определяли в отдельном варианте у экспериментальных животных, затравленных хлоридом никеля в течение 30 дней. Определяли по прошествии экспериментального времени концентрацию оксида азота и интенсивность системы ПОЛ - АОС. Систематизация результатов показала, что содержание NOх у подопытных животных при систематической интоксикации хлоридом никеля под влиянием L-аргинина повысилось, а содержание конечного продукта липопероксидации понизилось сравнительно с уровнем при никелевой интоксикации. АОС активировалась, в частности СОД. Следовательно, L-аргинин обладает способностью у затравленных хлоридом никеля животных нормализовать активность АОС, а также устранить в ней расхождение и несоответствие. На фоне модифицированного L-аргинина в крови увеличиваются продукты СРО, а именно конечный результат - МДА. Полученные результаты показали, что систематическая интоксикация тяжелым металлом (никель) вызывает угнетение АОС и повышение интенсивности липопероксидации. Эти изменения окислительно-восстановительных процессов в живой системе сопровождаются сниженным уровнем образования оксида азота и, соответственно, его содержания.
NO-синтаза в каждой субъединице содержит редуктазный и оксидазный домены, который в активном центре имеет гем. Взаимодействие между ними осуществляется путем транспорта электронов. С другой стороны, для активности энзима существенную роль играет кофактор тетрагидробиоптерин (ВН4).
При введении не только никеля, но и модифицированного L-аргинина имеет место нарушение внутренней молекулярной структуры eNOS. Двоякая функция eNOS свидетельствует о том, что энзим способен образовывать не только оксид азота, но и АМК.
Таким образом, решающими факторами, поддерживающими стабильность NOх, являются не только субстрат - L-аргинин, но и уровень воспроизведения eNOS, который может ингибироваться АДМА.
Другим фактором сниженной продукции NO может быть использование L-аргинина в цикле синтеза мочевины, т.е. в результате активности аргиназы. В условиях ингибирования аргиназы – как фармакологического агента на фоне L-норвалина - происходит увеличение концентрации L-аргинина и, как следствие, оксида азота [15].
Результаты показали большую эффективность комплексной терапии на систему ПОЛ – АОС и содержание NOx. Данные показали, что комбинированная терапия L-аргинин + L-норвалин более значительно снижает интенсивность ПОЛ и содержание МДА в эритроцитах, а также корригирует взаимоотношения между ферментами АОЗ, способствует повышению концентрации суммарных метаболитов NO, уровень которых достигает контрольных значений сравнительно с монотерапией L-аргинином.
Заключение. Таким образом, полученные нами данные демонстрируют антиоксидантные и NO-стимулирующие свойства L-аргинина и L-норвалина на фоне никелевой интоксикации и участие L-аргинина в механизмах регуляции экспрессии eNOS, а L-норвалина – в ингибировании аргиназы и повышении оксида азота.
Положительное влияние на функциональную активность сосудистого эндотелия оказывали изучаемые вещества – L-норвалин и L-аргинин. Оно проявлялось усилением продукции оксида азота, что сопровождалось снижением внутриклеточного содержания Са2+ и расширением сосудов микроциркуляции. Снижение уровня использования L-аргинина в орнитиновом цикле в результате ингибирования фермента аргиназы потенцирует эти эффекты.
Следовательно, комплексная терапия препятствует снижению концентрации суммарных метаболитов NO в крови. Это дает право рассматривать, что определяющую роль играет нормализация функции нитрооксидсинтазы.