На сегодняшний день активно ведется поиск средств неспецифической защиты от свободнорадикальных процессов, которые, как известно, могут являться причиной развития серьезных патологических процессов в организме, в том числе сопровождающихся тромбогеморрагическими осложнениями [1]. В этом отношении все большее значение в медицинской практике приобретают препараты и биологически активные добавки животного происхождения, оказывающие мощный антиоксидантный эффект [2-4]. Показано, что весьма перспективными в этом отношении являются средства, получаемые из жиров зимоспящих животных [5]. Чаще всего эти препараты используются как источники полиненасыщенных жирных кислот и витаминов [6-8].
Известно, что время, когда животные подвержены гибернации – это необходимый способ адаптации к понижению температуры окружающей среды. Именно в этот период в организме животных происходят радикальные изменения показателей гомеостаза.
Показано, что в этот время в организме животных может развиваться такое состояние, как гипероксигенация, а в связи с этим последующая активация свободнорадикальных процессов, мобилизация антиоксидантных систем, в том числе ферментных [9; 10]. Устойчивость же к активации свободнорадикальных процессов в этот период, как показывает ряд исследований [11; 12], им обеспечивает высокая активность антиоксидантных ферментов, большой запас в организме бурого жира, в котором преобладают ненасыщенные жирные кислоты (линолевая, линоленовая, олеиновая), а также витамины А, Е. Может быть, поэтому, именно благодаря этим свойствам животные жиры издревле использовали в отечественной и восточной народной медицине в лечении целого ряда заболеваний [13; 14].
В настоящее время имеются единичные научные подтверждения в области биохимического исследования и использования животных жиров в медицине. Чаще в этих работах данные субстанции рассматриваются в качестве средств, усиливающих регенерацию покровных тканей. Однако, учитывая мощный антиоксидантный потенциал данных препаратов, можно предположить их позитивный эффект в лечении целого ряда других патологий, причиной развития которых является активация свободнорадикальных процессов, в том числе и в области нарушений свертывания крови.
Цель исследования. Изучить параметры первичного и вторичного гемостаза в условиях эндогенного выброса тромбина на фоне дополнительного приема с пищей природных микстов «Барсучий жир», «Медвежий жир» (ООО «Багира», Россия).
Материалы и методы исследования. В обеих сериях экспериментов использовались (в качестве экспериментальных животных) нелинейные белые крысы (вес 350-400 г, возраст 3-4 мес.). Количество крыс в каждой группе составляло 12 в серии с барсучьим жиром, 14 – в серии с медвежьим жиром.
Животные содержались на стандартном сбалансированном рационе с необходимым количеством органических веществ и минералов. Дополнительно в пищу животным опытных групп добавляли природные миксты «Барсучий жир» (ООО «Багира», Россия), (далее барсучий жир), «Медвежий жир» (ООО «Багира», Россия), (далее медвежий жир). Введение крысам жиров осуществляли с помощью зонда 21 день (0,08 мл на 100 г веса животного), согласно инструкции по применению данных образцов. Дозы вводимых добавок для животных рассчитывались с учетом межвидового перерасчета доз на основе соотношений поверхности и массы тела животного Контрольные животные жиры не получали.
Забор крови все последующие операции проводили под действием наркоза (этоксиэтан). Яремную вену обнажали овальным разрезом и забирали образцы крови. Кровь для анализа забирали с 3,8% раствором цитрата натрия (1:9), для исследования тромбоцитарного гемостаза использовался забуференный раствор глутарового альдегида (0,125%). Все операции, начиная с забора крови, проводились согласно правилам, установленным для исследований, связанных с исследованием свертывания крови [15].
Оценку плазменного гемостаза (АЧТВ – активированное частичное тромбопластиновое время; ПТВ – протромбиновое время; ТВ – тромбиновое время; АТ–III – активность антитромбина–III; ФГ – содержание фибриногена, содержание РФМК) проводили по наборам фирмы «Технология-стандарт» (г. Барнаул) на коагулографе «Реалайт» (ООО «Дисксион», Россия). Концентрацию тромбоцитов (PLT) осуществляли с помощью световой микроскопии в камере Горяева по методу Шитиковой [15], а также на гематологическом анализаторе «Гемалайт» (ООО «Дисксион», Россия), общую коагуляционную активность тромбоцитов (ОКАТ) оценивали по изменению времени свертывания в плазме в тесте АВР (активированное время рекальцификации).
Состояние эндогенного выброса тромбина моделировали путем опробированной модели комбинированного стресса (гипотермия + физическая нагрузка): экспериментальных животных опускали в воду (+15 °С) на 30 минут, низкая температура воды заставляла их двигаться. Образцы крови забирали в следующие сроки: до воздействия, а также спустя 0,1, 1 и 3 ч после его окончания.
В опыте с барсучьим жиром активацию гемостаза моделировали с помощью острого холодового стресса: экспериментальных животных опускали в емкости с водой (+5 °С), затем подвергали экспозиции в окружающую среду (на 15 мин. при температуре -15 °С).
Результаты исследований, имеющие цифровое выражение, анализировали методом вариационной статистики для малых рядов наблюдений. Для оценки достоверности отличий вычисляли доверительный коэффициент Стьюдента (t) и степень вероятности (p). Различия считали достоверными при значениях p<0,05.
Результаты и обсуждение
С целью достижения цели нашего исследования нами было проведено две серии экспериментов. Сначала нами было изучено состояние гемостаза на фоне введения барсучьего жира в условиях активации выброса эндогенного тромбина.
С целью выполнения задач исследования нами был выбрана экспериментальная модель, приводящая к выбросу в сосудистое русло основного фермента гемостаза – тромбина. Известно, что тромбин – это полифункциональный фермент, который регулирует не только активность свертывающей системы, но и противосвертывающей и фибринолитической. Являясь ключевым ферментом свертывания крови, тромбин обеспечивает активацию всех клеток крови, в частности тромбоцитов, одновременно активируя ферменты плазмокоагуляции и фибринолиза.
Оценка параметров гемостаза в норме и в условиях острого стресса выявила следующие результаты.
В плазме крови контрольных животных в ответ на стрессовое воздействие произошло резкое снижение количества тромбоцитов. Уменьшение количества тромбоцитов сразу после воздействия составило 15%, через 30 минут - 30%. В плазме крови животных, получавших дополнительно природный микст, почти не наблюдалось изменения концентрации тромбоцитов (табл. 1).
Таблица 1
Показатели свертывания крови у животных на фоне активации гемостаза
|
Показатели |
Интактные животные |
Контрольные животные (не получали БАД) |
Животные (получали с рационом БАД) |
||
|
После стресса |
Через 30 мин. |
После стресса |
Через 30 мин. |
||
|
PLT, 1х109/л |
315,4±6,83 |
269,2±19,71 |
217,8±26,02 |
319,5±16,6* |
316±13,35* |
|
ФГ, г/л |
7,09±1,6 |
3,43±0,68 |
3,06±0,23 |
4,13±0,57 |
3,02±0,24 |
|
АЧТВ, с |
27,92±0,54 |
18,55±0,22 |
18,72±1,41 |
29,01±0,42* |
19,46±0,22 |
|
ПТВ, с |
7,97±0,59 |
22,92±0,48 |
17,54±2,21 |
17,93±0,48* |
23,67±0,51* |
|
ТВ, с |
51,57±0,51 |
44,23±1,25 |
43,93±1,79 |
29,6±2,35* |
43,53±2,27 |
|
АТ-III, % |
95,62±1,7 |
95,47±3,68 |
91,32±1,83 |
98,26±1,34 |
107,6±0,4* |
|
ОКАТ, % |
18,5±1,93 |
28,2±2,42 |
15,52±0,44 |
14,34±1,31* |
21,04±1,67* |
|
РФМК, мг% |
5,87±0,2 |
9,62±0,79 |
19±0,76 |
10,62±0,83 |
16,5±0,82 |
Примечание: PLT – количество тромбоцитов; АЧТВ – активированное частичное тромбопластиновое время, ПТВ – протромбиновое время, ТВ – тромбиновое время, ФГ – содержание фибриногена, АТ-III – активность антитромбина-III, ОКАТ – общая коагуляционная активность тромбоцитов, РФМК – растворимые фибринмономерные комплексы. Знаком * отмечены достоверно отличающиеся показатели (р <0,05) по сравнению с показателями контрольной группы животных.
В плазме крови контрольных животных произошла активация гемостаза: наблюдается рост общей коагуляционной активности тромбоцитов (на 51%) (табл. 1). В группах опытных животных изменения со стороны тромбоцитарного гемостаза не выходили за рамки физиологических.
Таким образом, у животных, получавших дополнительно жир, наблюдается снижение потребления тромбоцитов и ослабление их общей коагуляционной активности, что свидетельствует о более адекватной реакции в условиях стрессового воздействия.
Оценка параметров плазменного гемостаза показала, что у животных контрольной группы стресс-воздействие вызвало выраженные изменения, характерные для переходной фазы ДВС, а именно – рассогласование показателей клоттинговых тестов: уменьшение активированного частичного тромбопластинового времени (на 33%), удлинение протромбинового времени (в 3 раза), увеличение активированного времени рекальцификации (на 18%), уменьшение концентрации фибриногена (в 2 раза). Об активации тромбиногенеза свидетельствует и рост содержания РФМК на протяжении всего эксперимента (табл. 1).
В группах опытных животных происходили похожие изменения, но анализируемые показатели по свертыванию крови были почти аналогичны показателям животных, не подвергнутых стрессовому воздействию.
Воспроизведение апробированной модели комбинированного стресса (эндогенная тромбинемия) в группах животных, получавших с пищей медвежий жир, показало следующее.
Экспериментальная модель (комбинированный стресс) была подобрана таким образом, чтобы животные испытывали повышенную нагрузку, в частности физическую (животные, попав в воду, вынуждены были держаться на плаву) и, в связи с тем что температура воды составила всего лишь + 15 °С – гипотермическую. Известно, что стрессовые реакции такого типа вызывают у животных ускорение свертывания, вплоть до развития диссеминированного свертывания крови.
В результате эксперимента мы получили следующие данные: уже через 0,1 ч после стресса у животных контрольной группы развивалось состояние гиперкоагуляции. Наблюдалось резкое укорочение активированного частичного тромбопластинового времени (на 24,9%) и протромбинового времени (на 16,8%) и удлинение тромбинового времени. Существенно выросла концентрация растворимых фибринмономерных комплексов, произошло значительное потребление фибриногена. Закономерно увеличилась активность антитромбина-III (на 52,8%) (табл. 2).
Через час после стрессового воздействия наблюдалась глубокая гипокоагулемия (судя по результатам клоттинговых тестов), также наблюдалось существенное потребление антитромбина-III (произошло уменьшение активности почти в 2,3 раза).
Таблица 2
Показатели свертывания крови у животных, получавших и не получавших биологически активную добавку «Медвежий жир» на фоне активации гемостаза
|
Исследуемые показатели |
Сроки наблюдения в условиях комбинированного стресса |
|||
|
Без воздействия |
0,1 ч |
1 ч |
3 ч |
|
|
PLT, ×109/л |
958,2±26,1 |
1067,7±21,6* |
1287,8± 28,0* |
866,5±23,9* |
|
868,6±22,60 |
913,5±25,40 |
862,6±27,40 |
776,1±23,30* |
|
|
АЧТВ, с |
20,9±0,4 |
15,7±0,5* |
18,7±0,3* |
20,3±0,3 |
|
18,5±0,50 |
17,4±0,50 |
17,8±0,40 |
18,7±0,50 |
|
|
ПТВ, с |
27,9±0,3 |
23,2±0,4* |
14,7±0,9* |
29,6±0,3* |
|
29,8±0,60 |
22,3±0,7* |
13,2±0,1* |
28,1±1,3 |
|
|
ТВ, с |
19,1±0,7 |
21,7±1,0* |
17,3±0,7* |
26,6±0,6* |
|
23,6±0,80 |
19,7±1,8* |
18,6±0,9* |
22,7±0,40 |
|
|
ФГ, г/л |
4,0±0,1 |
3,7±0,1* |
5,9±0,3* |
5,1±0,2* |
|
5,0±0,10 |
4,6±0,2*0 |
3,0±0,1*0 |
4,1±0,1*0 |
|
|
АТ-III, % |
108,8±13,8 |
172,2±13,1* |
76,3±4,8* |
113,5±9,1 |
|
260,4±13,20 |
194,1±10,8* |
89,4±9,4* |
105,3±16,8* |
|
|
РКМФ, мг/% |
5,2±0,3 |
7,9±0,5* |
7,7±0,1* |
7,3±0,1* |
|
4,6±0,10 |
5,8±0,1*0 |
6,3±0,3*0 |
4,4±0,10 |
|
Примечания: первая строка по каждому показателю – контрольная группа, нижняя – опытная. Знаком * отмечены достоверно отличающиеся показатели (р <0,05) по сравнению с показателями животных без воздействия, знаком 0 – по сравнению с показателями первой строки.
К окончанию эксперимента (к исходу 3 часа) оставался повышенным показатель тромбинового времени (на 39,3%), что может быть связано с высокой концентрацией в плазме крови продуктов фибринолитической системы. Сохранялась нормальная концентрация фибриногена и активность АТ-III.
Необходимо отметить, что активированное частичное тромбопластиновое время сразу через 0,1 ч резко укорачивалось почти на 25%, в отличие от показателей животных, получавших биологически активную добавку. Данное обстоятельство и отличия в содержании тромбоцитов, фибриногена и РФМК в группе контрольных животных, позволяют рассматривать медвежий жир в аспекте его антистрессорного эффекта.
Таким образом, можно предполагать, что вещества, входящие в состав медвежьего жира, некоторым образом (что требует более тщательного изучения) ограничивают выброс в организме гормонов стрессорного ряда.
С целью подтверждения данного факта мы измерили концентрацию адреналина у животных контрольной и опытных групп.
Результаты выявили следующее: у контрольных животных к окончанию стрессового воздействия произошло сначала резкое потребление, а затем повышение концентрации адреналина в плазме крови.
У животных, получавших биологически активную добавку с пищей, концентрация адреналина была значительно меньше, чем в контроле, и оставалась постоянной на протяжении всего эксперимента. Таким образом, можно предполагать, что животные опытной группы (получавшие с пищей медвежий жир), были более устойчивы к воздействию стрессорного фактора, чем животные контрольной группы. Что также отразилось и на состоянии гемостаза.
В группе опытных животных последствия комбинированного стресса со стороны сосудисто-тромбоцитарного и коагуляционного гемостаза были менее выражены.
Анализируя показатели клоттинговых тестов, следует отметить, что активированное частичное тромбопластиновое время в этих группах не отличалось от показателей исходных цифр, также показатель тромбинового времени и содержание растворимых фибринмономерных комплексов были ниже, чем в группе контрольных животных, а к окончанию эксперимента даже вернулись к исходному значению (табл. 2).
В группе контрольных животных было установлено увеличение содержания тромбоцитов (уже к 1 ч на 34,3 %), причем с преобладанием активированных форм. Также в плазме крови наблюдалось образование больших и малых тромбоцитарных агрегатов.
Напротив, в группе животных, получавших с пищей данный природный микст, роста концентрации тромбоцитов не происходило (табл. 2). Наблюдалось также образование активированных форм, но их концентрация в ходе всего эксперимента оставалась постоянной, таким образом, часть тромбоцитов, вовлеченных в образование малых агрегатов, была постоянной.
Заключение
Таким образом, дополнительное введение животным с пищей барсучьего и медвежьего жиров ограничивает последствия эндогенной тромбинемии со стороны тромбоцитарного и коагуляционного звеньев гемостаза, а также повышает противосвертывающий потенциал.
На основании этого можно предполагать, что изучаемые жиры при употреблении их в оптимальных дозах способны ограничивать последствия гиперкоагуляции путем ограничения активации как внешнего, так и внутреннего пути плазмокоагуляции, а учитывая то, что эти пути взаимно потенцируют друг друга, становится понятно насколько позитивным может быть эффект влияния данных биологически активных добавок на гемостаз в условиях острого стресса.
В связи с этим можно полагать, что при условии раскрытия более детального механизма влияния химических компонентов жиров животного происхождения на систему свертывания крови возникает реальная перспектива их использования в качестве эффективных средств профилактики тромбогеморрагических осложнений.