В последние годы в области исследования проблем канцерогенеза особое внимание уделяется изучению метаболических процессов, протекающих в митохондриях опухолевых клеток. Гипотезу о том, что возникновение и развитие злокачественных новообразований связано с нарушением клеточного дыхания и компенсаторным усилением гликолиза, первым выдвинул О. Варбург [1].
В ходе дальнейшего изучения проблемы был предпринят ряд попыток объяснить эту особенность энергетики канцерогенеза – возникли мембранная теория С.А. Нейфаха, изоэнзимная гипотеза В.С. Шапот, митохондриальная теория рака А.И. Зотина [2-4].
Согласно мембранной теории изменение энергетики клетки связано с повреждением мембран митохондрий и разобщением протекающих в ней биохимических процессов [2]. С позиции изоэнзимной гипотезы причиной метаболического сдвига является нарушение последовательности синтеза изоформ некоторых ферментов, в результате изменяется их соотношение, что влечет за собой увеличение скорости гликолиза [3]. В соответствии с концепцией митохондриальной теории рака развитие злокачественных опухолей связано с появлением в клетках мутантных форм митохондрий, имеющих дефекты в наружной мембране, что приводит к увеличению ее проницаемости и, как следствие, изменению регуляторных механизмов дыхания и гликолиза. В рамках этой теории были предприняты первые попытки объяснить, как изменения в митохондриях, влияющие на формирование энергетического метаболизма ракового типа, связаны с функциональным состоянием онкогенов трансформированных клеток [4].
Несмотря на то что авторы перечисленных гипотез имеют различный взгляд на проблему, они не противоречат, а скорее дополняют друг друга, так как дефекты митохондрий и их мембран могут приводить к нарушению работы расположенных в них ферментативных систем, что в свою очередь ведет к перестройке метаболических процессов - так происходит формирование нового типа клеток с высокой скоростью гликолиза.
В свете этих теорий особое значение имеет изучение митохондриальных ферментов. В контексте исследования роли митохондриальных белков в развитии злокачественных опухолей одним из наиболее интересных и перспективных является сукцинатдегидрогеназа.
Сукцинатдегидрогеназа (сукцинат-убихинон-оксидорекдуктаза, СДГ, SDH) – это гетеротетрамерный мембранно-протеиновый комплекс, состоящий из 4 субъединиц, расположен во внутренней мембране митохондрий. Субъединицы A и B обладают гидрофильными свойствами и обращены в матрикс, а субъединицы C и D – гидрофобны и находятся непосредственно в фосфолипидном слое внутренней мембраны [5-7].
СДГ одновременно участвует в цикле трикарбоновых кислот, окисляя сукцинат до фумарата, и переносе электронов, восстанавливая убихинон, представляя собой II белковый комплекс электронтранспортной цепи [8-10]. Таким образом, СДГ является одним из ключевых звеньев в процессе энергообеспечения клетки.
Несмотря на большое количество работ, посвященных изучению СДГ и других митохондриальных ферментов [11-13], их роль в изменении биоэнергетики клетки при развитии злокачественных опухолей не вполне ясна, так как результаты некоторых исследований носят неоднозначный характер [14-16].
В ряде исследований была убедительно продемонстрирована взаимосвязь между нарушением функциональной активности митохондрий, разобщением работы дыхательных ферментов и прогрессированием злокачественных новообразований [17-19].
В наших работах по оценке влияния электромагнитных полей на неспецифическую противоопухолевую резистентность было показано достоверное снижение, а в 41% случаев полное отсутствие гранул формазана – окрашенного продукта реакции СДГ с нитротетразолием фиолетовым в лимфоцитах периферической крови у животных с прогрессирующей опухолью (штамм саркомы 45), что указывает на прямую связь энергетических процессов с ростом злокачественных новообразований [20].
Взаимосвязь активности митохондриальных ферментов со степенью прогрессии/регрессии опухоли выявлена в работе по изучению воздействия комбинированной противоопухолевой терапии, а именно сочетания курсового введения циклофосфана и циклического аденозинмонофосфата (цАМФ). При регрессии опухоли отмечался более высокий уровень активности СДГ по сравнению с контрольной группой [21]. Это подчеркивает необходимость использования в противоопухолевой терапии факторов управления клеточного метаболизма, ключевую роль в котором играет цАМФ.
Используемый в вышеперечисленных исследованиях цитобиохимический метод оценки энергопродукции лимфоцитов стал стандартным критерием, позволяющим измерить ряд показателей активности СДГ, определить различные функциональные состояния митохондрий и получить представления об энергетическом метаболизме клеток в норме и при патологии.
Представления о роли СДГ как о носителе информации о канцерогенезе значительно расширили исследования в области генетики и молекулярной биологии [22-24]. Открытие мутаций в генах, кодирующих ферменты изоцитратдегидрогеназу, сукцинатдегидрогеназу и фумаразу, не только помогло раскрыть принципы перепрограммирования метаболических путей, но и понять механизмы эпигенетической дисрегуляции при раке [23].
СДГ и фумараза действуют как супрессоры опухолей, а их геномная инактивация приводит к накоплению сукцината и фумарата соответственно. Избыток фумарата, связанный с мутациями фумаразы, может привести к снижению активности сукцинатдегидрогеназы и увеличению концентрации сукцината в дефицитных по фумаразе опухолях. Дефицит СДГ может возникать в результате зародышевых мутаций его субъединиц A, B, C или D и обнаруживается при аутосомно-доминантной семейной параганглиоме/феохромоцитоме и синдроме Карни-Стратакиса (комбинации параганглиомы и желудочно-кишечной стромальной опухоли).
Напротив, пациенты с не наследственными типами опухолей, включая параганглиому, желудочно-кишечную стромальную опухоль и легочную хондрому, обычно не имеют зародышевых мутаций СДГ, у них инактивация данного фермента происходит вследствие метилирования промотора субъединицы C [24]. В метастатических феохромоцитомах и параганглиомах мутации субъединицы B связаны с активацией SNAIL/SLUG-сигнального пути в результате эпигенетического ремоделирования за счет гиперметилирования промоторных островков CpG [25-27].
Гипотезу о том, что функциональное состояние СДГ влияет на развитие опухолевого процесса, также подтверждают сведения о том, что катехоламинпродуцирующая абдоминальная параганглиома ассоциирована с мутацией гена субъединицы А. В исследовании Burnichon N. и соавт. было убедительно продемонстрировано, что данная мутация приводит к потере активности СДГ в опухолевых тканях [28]. Кроме того, мутации гена субъединицы B являются фактором, обуславливающим злокачественность феохромоцитом и параганглиом, а также предиктором неблагоприятного прогноза [26]. Дефекты субъединицы B были идентифицированы при серозном раке яичника [29], колоректальном раке [30] и при семейной почечно-клеточной карциноме [31].
Дисфункция субъединицы B СДГ также влияет на подавление α-кетоглутаратзависимого синтеза гистоновых и ДНК-деметилаз, которые могут влиять на экспрессию генов-супрессоров опухолей и онкогенов [32].
Таким образом, показано, что потеря функциональной активности СДГ является предрасполагающим фактором аэробного гликолиза и прогрессирования рака, однако механизмы, лежащие в основе биоэнергетического переключения клеток с одного типа энергообеспечения на другой, до сих пор не вполне понятны. Было высказано предположение, что дефицит или отсутствие функциональной активности СДГ провоцирует переход клетки на аэробный гликолиз опосредованно через АМФ-активируемую протеинкиназу – белок, контролирующий энергетическое равновесие клетки [19].
В пользу этой гипотезы свидетельствуют результаты работы Xiao Z. и соавт. – анализ экспрессии профилей АМФ-активируемой протеинкиназы (АМФК) и субъединицы B СДГ показал снижение экспрессии белка субъединицы B в тканях, пораженных колоректальным раком, по сравнению с тканями паракарциномы, тогда как экспрессия AMФK была увеличена при колоректальном раке. В in vitro моделях сверхэкспрессии и нокдауна субъединицы B СДГ с применением культуры клеток карциномы толстой кишки HT-29 было показано, что нокдаун увеличивает экспрессию АМФК и фАМФК, в то время как избыточная экспрессия субъединицы B СДГ уменьшает экспрессию только АМФК. Эксперименты, связанные с потерей или усилением функции СДГ, показали, что этот белок регулирует экспрессию и активность АМФК по принципу отрицательной обратной связи [9].
Снижение экспрессии субъединицы B СДГ способствовало выживаемости, миграции и инвазии клеток карциномы толстой кишки HT-29, в то время как сверхэкспрессия нарушала их миграцию и инвазию. При ингибировании и активации АМФК был получен противоположный эффект. Эти результаты показывают, что АМФК может опосредовать влияние сукцинатдегидрогеназы на пролиферацию и миграцию клеток при колоректальном раке [9].
Похожие результаты продемонстрированы в эксперименте с мышами, нокаутированными по гену субъединицы B сукцинатдегидрогеназы. Было показано, что проведение инъекций культуры клеток гепатоцеллюлярной карциномы в хвостовую вену и подкожно приводило к образованию опухоли большого объема и ускоренному метастазированию рака [33]. Установлено, что снижение экспрессии субъединицы B СДГ связано cо степенью прогрессии опухоли и плохой выживаемостью особей [33].
Недавние исследования выявили, что мутации, обуславливающие потерю ферментативной активности СДГ и, как следствие, накопление сукцината и фумарата, активируют гипоксия-индуцибельный фактор HIF-1α и его нисходящий гликолитический путь. HIF-1α инициирует экспрессию генов, ответственных за усиление гликолиза, а также вовлеченных в процесс ангиогенеза [33].
В норме в тканях содержится небольшое количество HIF-1α благодаря непрерывному расщеплению его специфическими ферментами, а при опухолевой гипоксии происходит торможение этой реакции. Авторы предполагают, что нарушение расщепления, накопление и активация HIF-1α связаны с дефектом СДГ и, следовательно, с накоплением сукцината, который в свою очередь ингибирует фермент, ответственный за деградацию HIF-1α. Помимо этого, HIF-1α снижает скорость окислительного декарбоксилирования пирувата, ингибируя пируватдегидрогеназу и влияя на интенсивность окислительного фосфорилирования [34]. При этом в некоторых опухолях наблюдается высокая активность HIF-1α даже в присутствии кислорода. Это состояние, известное как псевдогипоксия, продемонстрировано на примере новообразований, связанных с потерей функций или отсутствием опухолевого супрессора pVHL (Von Hippel–Lindau), сукцинатдегидрогеназы или фумаратгидратазы. Таким образом, гипоксические условия и активация HIF-1α связаны с первичными нарушениями обменных процессов в митохондриях, которые могут приводить к злокачественному перерождению клетки [34], однако представленные в литературе результаты изучения данного феномена противоречивы [13].
Не вполне однозначные данные представлены в работе по определению активности митохондриальных ферментов сукцинатдегидрогеназы (СДГ) и цитохромоксидазы (ЦХО) в тканях при раке яичников. Показан более низкий уровень активности этих ферментов у больных раком яичников на всех клинических стадиях заболевания как в группе женщин с репродуктивным возрастом, так и в группе женщин, находящихся в менопаузе, по сравнению с группой условно здоровых пациенток. Анализ СДГ и ЦХО в динамике показал тенденцию к снижению активности в каждой последующей стадии заболевания по отношению к предыдущей. Интересно отметить, что в данном исследовании, несмотря на общую однонаправленность изменений, в группе с раком яичников были зарегистрированы отдельные случаи активности фермента, превышающей таковую в тканях здоровых яичников [13].
Такие парадоксальные результаты авторы объясняют тем, что, вероятнее всего, в составе опухолей присутствует несколько клонов клеток с разным типом метаболизма, в частности, отличающихся по уровню ферментативной активности. Известно, что механизмы метаболического перепрограммирования во многом зависят от опухолевого микроокружения [35; 36]. Одно поколение клеток развивается в гипоксических условиях, которые провоцируют обширный ангиогенез, соответственно, следующие поколения развиваются в условиях реоксигенации. Различия в тканевом микроокружении приводят к тому, что в нескольких поколениях могут быть активированы альтернативные метаболические пути энергообеспечения [13].
В работе по изучению тканевого дыхания и гликолиза при опухолевом процессе показано, что в митохондриях, выделенных из быстрорастущих гепатом, окисление сукцината протекало с той же скоростью, как и в клетках здоровой печени, но при этом соотношение АДФ/АТФ свидетельствовало о повышении проницаемости митохондриальной мембраны [32; 37]. Также установлено, что в опухолевых клетках пациентов, независимо от диагноза или типа опухоли, цитоплазма содержала повышенное количество митохондрий, лишенных крист и имеющих другие структурные аномалии [38]. Эти данные указывают на наличие митохондриальных дефектов, но не на потерю ферментативной активности СДГ [32; 37].
Также было обнаружено, что при дефиците глюкозы раковые клетки могут переключаться с гликолиза на окислительное фосфорилирование или комбинировать эти процессы в зависимости от своих энергопотребностей и биодоступности энергетических субстратов и ферментов [37; 39; 40].
В частности, при ингибировании лактатдегидрогеназы или активации пируватдегидрогеназы происходит индукция окисления пирувата в митохондриях и стимуляция тканевого дыхания [41; 42]. Это указывает на то, что в этих клетках нет нарушений функционального состояния митохондриальных ферментов и развитие опухоли может быть не связано с мутациями в генах, влекущих за собой потерю ферментативной активности. В то же время ряд опухолевых клеточных линий, для которых основным способом получения энергии является гликолиз, при недостатке глюкозы демонстрирует способность обеспечивать себя энергией за счет окислительного фосфорилирования [39].
Дальнейшие исследования на примере моделей опухолей молочной железы и легких показали, что клеточный переход от гликолиза к митохондриальному окислительному фосфорилированию инициируют ингибиторы мультитирозинкиназы антиангиогенеза, и это метаболическое переключение происходит посредством подавления HIF-1α и повышения активности АМФ-активируемой протеинкиназы (AMФK). AMФK непосредственно контролирует энергетическое равновесие клетки: она активируется при значительном потреблении энергии и нарастании внутриклеточного содержания АМФ, в результате чего клетка переходит в энергосберегающее состояние [43].
Такая пластичность механизмов образования энергии в зависимости от микроокружения, вероятно, является следствием своеобразного отбора и формирования клона клеток с нестабильным геномом. Нестабильность генома обуславливает их способность быстро адаптироваться к меняющимся условиям, что, в свою очередь, обеспечивает высокую выживаемость раковых клеток наряду с пониженной чувствительностью к иммунным атакам и сигналам, инициирующим апоптоз.
Подобного рода перепрограммирование, характеризующееся сдвигом в энергообеспечении от дыхания к гликолизу, является важной, но не обязательной чертой, присущей раковым клеткам. Изменения активности митохондриальных ферментов отражают лишь часть всей картины метаболической перестройки при канцерогенезе.
Тем не менее связь между биоэнергетическими изменениями и прогрессированием опухоли важна для понимания канцерогенеза и для дальнейшего определения потенциальных терапевтических целей. Более детальное понимание роли митохондриальных ферментов, в том числе и СДГ, при канцерогенезе может способствовать разработке новых методов лечения, которые будут нацелены на функциональные изменения в опухолевых клетках.