Токсичные вещества, нарушая функции мембран, во многих случаях являются причиной патологических изменений, происходящих в клетке и в организме в целом [1; 2]. В настоящее время изучению влияния ионов тяжелых металлов на систему крови уделяется большое внимание [3]. Токсическое действие этих соединений преимущественно обусловлено взаимодействием с белками мембраны клеток, особенно крови, иммунной, эндокринной и центральной нервной систем [4].
На территории Республики Башкортостан расположены крупнейшие медно-колчеданные месторождения. Несмотря на использование современных технологий добычи цветных руд и применение высокотехнологичной техники, условия труда работников горнодобывающей промышленности остаются потенциально опасными. Добыча руды всегда связана с повышенным риском возникновения профессиональных заболеваний у рабочих. При изучении профессиональных заболеваний у горняков были выявлены болезни органов дыхания, нейросенсорная тугоухость, а также заболевания костно-мышечной системы. Эти заболевания развиваются как вследствие тяжелого физического труда, так и в результате воздействия вредных факторов рабочей среды и трудового процесса [5]. В плазме крови у рабочих горно-обогатительных комбинатов определялся завышенный уровень биохимических маркеров функции печени и многократное увеличение содержания кадмия, свинца, цинка и меди в печени, почках и легких. Развивающийся дисэлементоз свидетельствует о поступлении и накоплении в организме тяжелых металлов [4].
Ранее нами было подтверждено мембранотоксическое действие медно-цинковой колчеданной руды при анализе осмотической устойчивости эритроцитов крыс [6]. В данном исследовании нами была изучена кислотная резистентность эритроцитов, которая, как известно, отражает интенсивность и характер кроветворения, в том числе эритропоэз в норме и при различных патологиях организма [7].
Цель исследования
Цель исследования заключалась в изучении гематологических показателей периферической крови и кислотной резистентности эритроцитов (КРЭ) под воздействием медно-цинковой колчеданной руды на организм лабораторных крыс.
Материалы и методы исследования
Исследования были проведены на 40 беспородных крысах самцах (200-250 г) с соблюдением соответствующих требований этических норм и международных рекомендаций о гуманном отношению к животным, которые используются в научных целях. Животным опытной группы (n=20) перед стандартным кормлением в течение 30 дней вводили перорально руду, измельченную в порошок, из расчета 60 мг руды на 100 г веса крысы. Кровь собирали из хвостовой вены крысы на 10-е и 30-е сутки эксперимента. Кислотную резистентность определяли с помощью метода эритрограмм, который графически характеризует процесс вовлечения популяций эритроцитов различной стойкости во время гемолиза. Последовательное вступление эритроцитов в процесс гемолитической трансформации представляет функциональную зависимость в следующем виде: G = f(t), где G – количество гемолизированных эритроцитов в %, и t – время в минутах. Степень гемолиза эритроцитов в слабом растворе соляной кислоты определяли на спектрофотометре ПЭ-5400ВИ (ООО «Экохим») при длине волны 640 нм с помощью программы кинетического анализа Kin5400. По полученным значениям строились кислотные эритрограммы. Анализ кислотных эритрограмм проводили по следующим параметрам: время начала, окончания и пика гемолиза, общее время гемолиза. Для сравнения соотношения популяций эритроцитов с разной устойчивостью по эритрограммам рассчитывались доли клеток, разрушающихся в следующих временных интервалах: 0–1,5 мин. - популяция низкоустойчивых клеток; 1,5–3 мин. - популяция среднеустойчивых клеток; 3-4,5 мин. - популяция высокоустойчивых клеток; 4,5–9 мин - популяция клеток повышенной стойкости [8-10].
Оценку клеточного состава красной крови и эритроцитарных индексов проводили с помощью гематологического анализатора «Эксиго» (Vet Exigo 19, Sweden) [6; 11; 12]. Статистическую обработку результатов проводили, используя программы StatSoft Statistica10 и MS Excel 2010, t-критерий Стьюдента, определяли медиану, верхний (Q1) и нижний (Q3) квартили. Различия между опытной и контрольной группами считались достоверными при р< 0,05.
Результаты и обсуждение
В опытной группе наблюдались значительные изменения индексов красной крови. В приведенной ниже таблице представлены количественные показатели красной крови на 10-е и 30-е сутки введения медно-цинковой колчеданной руды в организм животных.
Снижение количества эритроцитов у крыс отмечалось на 30-е сутки экспозиции препарата. Такая же динамика была характерна для гематокрита. Полученные данные позволили полагать, что соотношение объема плазмы и эритроцитов в периферической крови крыс, подвергнутых интоксикации рудой, не приводило к увеличению вязкости крови. Показатель ширины распределения эритроцитов достоверно увеличился на 10-е сутки, а на 30-е сутки снизился до величины показателя контрольной группы крыс. Обратная динамика наблюдалась в отношении показателя средней концентрации гемоглобина в эритроцитах, который достоверно снизился на 10-е сутки по сравнению с контрольным значением и увеличился на 30-е сутки эксперимента.
Показатели периферической крови крыс в контроле и в эксперименте (10-е и 30-е сутки)
|
Параметры |
Контрольная группа |
Опытная группа |
|
|
10 суток |
30 суток |
||
|
Абсолютное количество эритроцитов (х1012/л) |
7,48 [7,26-7,98] |
7,26 [6,93-7,52] |
6,25*Δ [5,85-7,17] |
|
Гематокрит (%) |
38,95 [37,55-40,6] |
37,85* [36,0-39,3] |
31,8*Δ [31,8-37,1] |
|
Содержание гемоглобина (г/л) |
142,0 [137,0-148,0] |
132,0* [126,0-136,0] |
113,0*Δ [112,0-127,0] |
|
Средний объем эритроцитов (фл) |
51,1 [50,45-53,15] |
52,1 [51,5-52,75] |
52,8* [51,1-55,1] |
|
Ширина распределения эритроцитов (%) |
21,9 [21,35-22,4] |
24,55* [23,15-25,95] |
21,6Δ [21,1-22,1] |
|
Средняя концентрация гемоглобина в эритроцитах (г/л) |
365,5 [362,0-370,0] |
347,5* [346,0-350,5] |
356,0*Δ [353,0-357,0] |
|
Среднее содержание гемоглобина в эритроцитах (пг) |
18,75 [18,45-19,35] |
18,2 [18,05-18,3] |
18,6 [18,2-19,4] |
Примечания: *р<0,05 - показатель опытной группы достоверно отличается от показателя контрольной группы; Δр<0,05 - показатели в опытной группе достоверно отличаются по срокам эксперимента.
Для определения механизмов, лежащих в основе обнаруженного эффекта действия медно-цинковой колчеданной руды, был проведен анализ кислотных эритрограмм, который дает информацию о распределении эритроцитов кровяного русла по устойчивости к кислотному гемолизу.
На рис. 1 представлены эритрограммы кислотной устойчивости периферической крови крыс опытной и контрольной групп на 10-е и 30-е сутки эксперимента.
Рис. 1. Эритрограммы кислотной устойчивости эритроцитов в эксперименте с медно-цинковой колчеданной рудой
В контрольной группе главный пик кислотной эритрограммы приходился на 2,69±0,09 мин и соответствовал популяции среднеустойчивых клеток. Две незначительные вершины соответствовали популяции клеток повышенной стойкости, продолжительность гемолиза составила 7,0±0,51 мин. На 10-е сутки в опытной группе наблюдался сдвиг главного пика кислотной эритрограммы вправо относительно контроля и соответствовал 3,42±0,13 мин. Это могло свидетельствовать об увеличении кислотной резистентности популяции высокоустойчивых эритроцитов. В то же время отмечалось значительное снижение общей продолжительности гемолиза до 5,57±0,27 мин, что указывало на уменьшение доли клеток повышенной устойчивости. На 30-е сутки эксперимента главный пик кислотной эритрограммы опытной группы соответствовал 2,42±0,07 мин, данное значение было таким же, как у основного пика эритрограммы контрольной группы крыс.
Наиболее полное представление о реакции клеток на кислотный гемолитик дает дифференциальная кривая распределения эритроцитов по устойчивости. На рис. 2 представлена диаграмма соотношения популяций эритроцитов с разной кислотной устойчивостью на 10-е и 30-е сутки эксперимента в контрольной и в опытных группах.
Рис. 2. Соотношение популяций эритроцитов в контрольной и опытных группах:
1 - популяция низкоустойчивых клеток; 2 - популяция среднеустойчивых клеток;
3 - популяция высокоустойчивых клеток; 4 - популяция клеток повышенной стойкости; *р<0,05 - показатель опытной группы достоверно отличается от показателя контрольной группы
Полученные данные свидетельствовали о том, что под влиянием медно-цинковой колчеданной руды в опытной группе на 10-е сутки эксперимента доля популяции среднеустойчивых клеток (36,26±5,9%) в сравнении с контрольной группой (61,73±6,12%) достоверно снизилась на 25,37%. Доля популяции высокоустойчивых клеток (50,59±5,7%) при этом достоверно увеличилась на 39,46% по сравнению с контрольным значением (11,13±2,7%). На 30-е сутки количество клеток в популяции среднеустойчивых клеток увеличилось до 70,87±4,81%, в основном за счет снижения популяции высокоустойчивых клеток (5,93±1,06%). Популяция клеток повышенной устойчивости в опытных группах уменьшилась относительно значения контрольной группы (12,78±3,8%) на 10-е сутки эксперимента и составила 3,01±1,5%, а на 30-е сутки соответственно 5,05±1,24%.
Заключение и выводы
Анализ взаимосвязей между количественными гематологическими показателями красной крови и распределением популяций эритроцитов по кислотной резистентности свидетельствует о том, что в контрольной группе при уменьшении КРЭ их численность, объем и содержание гемоглобина возрастало, и, напротив, возрастание доли низкоустойчивых клеток сопровождалось уменьшением количества эритроцитов и их качественных и количественных характеристик. Такое взаимодействие показателей свидетельствует о вкладе резистентности клеток в регуляцию численности и качественного состава эритроцитов. На 10-е сутки эксперимента увеличение среднего объема эритроцитов и увеличение доли популяции среднеустойчивых клеток происходило на фоне снижения гематокрита, гемоглобина и средней концентрации гемоглобина в эритроцитах [6]. На эритрограмме данное состояние характеризуется возрастанием доли популяции высокоустойчивых клеток, смещением основного пика вправо, а также снижением продолжительности гемолиза. Таким образом, можно предположить, что данные взаимоотношения отражают компенсаторные процессы, так как в эти сроки костный мозг экспериментальных животных пытается восполнить сниженное количество эритроцитов появлением в крови популяции клеток, более устойчивых к гемолизу, и направленные на поддержание общей дыхательной поверхности крови.
Профессор А.Ф. Каюмова в своих работах указывает на то, что влияние, например, гербицида 2,4-дифенилфеноксиуксусной кислоты на систему крови экспериментальных животных приводило к увеличению времени продолжительности кислотного гемолиза; сдвигу «пиков» эритрограмм вправо и развитию ретикулоцитоза. Появление этих признаков указывает на активирование эритропоэза и, как следствие этого - омоложение эритроцитов в периферической крови [13; 14].
Действие медно-цинковой колчеданной руды на кровь расценивается как действие сильного гипоксического раздражителя с развитием стресса эритропоэза (10-е сутки), с последующим его угнетением к концу эксперимента (30-е сутки), что подтверждается данными эритрограмм КРЭ. На 30-е сутки наблюдается сдвиг пика эритрограммы в область значений контрольной группы, но с такой же короткой продолжительностью гемолиза, как и на 10-е сутки. Средний объем эритроцитов возрастает по мере уменьшения доли популяции клеток высокой устойчивости, увеличение размера клеток не сопровождается увеличением количества клеток, а также наблюдается анизоцитоз [15]. Кроме того, полученные данные подтверждают прямое влияние токсического действия руды на эритроциты и подавление пролиферации в костном мозге. Срыв адаптационных возможностей костного мозга под влиянием медно-цинковой колчеданной руды позволяет нам нацелиться на более детальное изучение эритропоэза, а именно исследование эритробластических островков, как структурно-функциональную единицу эритропоэза.
Таким образом, действие медно-цинковой колчеданной руды в эксперименте в течение 30-ти суток приводит к изменению морфофункциональных свойств эритроцитов, изменению их кислотной устойчивости. Гемолитическое действие ионов тяжелых металлов на мембрану эритроцитов в конечном счете приводит к снижению индексов красной крови и появлению нормохромной макроцитарной анемии, что связано с нарушением эритропоэза в костном мозге экспериментальных крыс, получавших медно-цинковую колчеданную руду.