На фармацевтическом рынке имеется большое число лекарственных препаратов и их комбинаций, которые широко применяются врачами для лечения патологии системы крови. Известно, что к состояниям повышенной кровоточивости или угрожающим жизни кровотечениям часто приводят не только гематологические заболевания, но и заболевания и травмы других органов и систем. Подбор лекарственного препарата в каждом конкретном случае затрудняет не только широкий выбор лекарств, но и наличие определенных противопоказаний, побочных эффектов лекарственных средств, а иногда и отсутствие необходимых лекарственных форм. Таким образом, поиск новых более эффективных лекарственных веществ, обладающих гемостатическими свойствами, в настоящее время является особенно актуальным. С этой целью в АО «Всероссийский центр по изучению безопасности биологически активных веществ» г. Старая Купавна были синтезированы соединения - производные гидрохинонсульфокислоты.
В состав молекулы гидрохинонсульфокислоты входят сульфокислота и фенольное соединение дигидроксибензол (гидрохинон). Известно, что сульфокислоты являются промежуточными веществами в синтезе ряда лекарственных препаратов, таких как анальгин, диазолин и др. Сульфогруппы усиливают действие антибактериальных и сульфамидных препаратов.
Гидрохинон (дигидроксибензол) используют для синтеза многих лекарственных средств, в том числе эта молекула лежит в основе химической структуры ангиопротектора и корректора микроциркуляции этамзилата. Общеизвестно, что этамзилат часто применяют для профилактики и лечения послеоперационных кровотечений, кровотечений на фоне онкологических и других деструктивных заболеваний, для лечения геморрагического синдрома, вызванного передозировкой антикоагулянтов непрямого действия, гастродуоденальных кровотечений, а также используют для профилактики внутримозговых геморрагий [1]. Этамзилат обладает кровоостанавливающим действием, оказывает сложное ангиопротекторное действие, которое включает защиту эндотелия сосудов, стабилизацию стенок капилляров и нормализацию их проницаемости при патологических процессах, что улучшает микроциркуляцию и повышает адгезию тромбоцитов [2].
В серии предыдущих экспериментов [3; 4] было отмечено, что среди производных гидрохинонсульфокислоты ((OH)2C6H4SO3H) имеются биологически активные вещества, обладающие низкой токсичностью, а также способностью уменьшать выраженность активной кожной анафилаксии у мышей и умеренной антиэкссудативной активностью. Наличие противоаллергической и противовоспалительной активностей, вероятно, связано с наличием в молекуле исследуемых веществ дигидроксибензола, проявляющего выраженные антиоксидантные свойства [5]. Так как воспалительная реакция является патогенетическим звеном раневого процесса, выявленные свойства изучаемых соединений сыграют положительную роль в ускорении заживления раневой кровоточащей поверхности.
В связи с изложенным выше исследование влияния производных гидрохинонсульфокислоты на агрегантную активность системы крови представляет научный интерес в процессе поиска лекарственных препаратов, обладающих гемостатической активностью.
Цель исследования – изучение и оценка проагрегантной активности нового производного гидрохинонсульфокислоты с лабораторным шифром ЛХТ 5-10, синтезированного в АО «Всероссийский центр по изучению безопасности биологически активных веществ» (АО «ВНЦ БАВ», г. Старая Купавна, Россия) в экспериментах in vitro.
Материал и методы исследования
Экспериментальное исследование было одобрено Этическим комитетом ФГБОУ ВО «Тверской ГМУ» Минздрава РФ. При проведении исследования использовали кровь здоровых доноров. Перед началом эксперимента все добровольцы были ознакомлены с целями, задачами и процедурой исследования, с возможным риском и ожидаемыми результатами, а также правилами подготовки к исследованию. Участники подписывали информированное согласие.
К исследованию не были допущены добровольцы с заболеваниями крови, острыми и хроническими инфекционными заболеваниями, тяжелой соматической и онкологической патологией, эндокринными расстройствами, исключали курящих лиц, употреблявших накануне исследования алкоголь и лекарственные препараты (в том числе, нестероидные противовоспалительные препараты, антибиотики, антиагреганты, антикоагулянты и др.).
Агрегационную способность тромбоцитов анализировали турбидометрическим оптическим методом по Борну и О´Брайену и методом З.А. Габбасова с помощью двухканального лазерного анализатора агрегации тромбоцитов/счетчик модель 230 LA, производства НПФ «БИОЛА» ВНПКЦ г. Москва. Данный анализатор позволяет регистрировать агрегацию тромбоцитов в реальном времени путем анализа флюктуаций светопропускания, вызванных случайным изменением количества частиц в оптическом канале анализатора. Относительная дисперсия этих флюктуаций является пропорциональной среднему размеру агрегатов [6]. Достоинством данного метода является его высокая чувствительность, что позволяет использовать его для исследования спонтанной агрегации тромбоцитов, агрегации, стимулированной низкими концентрациями индукторов, а также агрегации субклеточных структур и макромолекул. К недостаткам метода относят то, что показатель агрегации отражает только относительное увеличение среднего радиуса агрегатов и равен нулю при отсутствии агрегации [7].
Забор крови осуществляли утром натощак из локтевой вены в одноразовые стерильные вакуумные пробирки (системы вакуумного забора крови «BD Vacutainer®») с буферным раствором 3,2% цитрата натрия в соотношении кровь : цитрат - 9 : 1.
Обогащенную тромбоцитами плазму (ОТП) получали путем центрифугирования при 1000 g в течение 10 минут при комнатной температуре (15-25 °С). Из пробирки отбирали 2,5 мл верхнего слоя (супернатанта). Бедную тромбоцитами плазму (БТП) получали повторным центрифугированием остатков крови при 3000 g в течение 15 минут. Светопропускание ОТП принимали за 0%, светопропускание БТП – за 100%. В работе использовали центрифугу UNICO® PowerSpin TM LX.
На первом этапе исследования изучали проагрегантную активность нового производного гидрохинонсульфокислоты с лабораторным шифром ЛХТ 5-10. На втором этапе исследовали влияние на агрегационную способность тромбоцитов плазмы препарата сравнения – ангиопротектора и гемостатика этамзилата. Полученные на первом и втором этапах данные сравнивали с контролем и между собой.
Данные соединения добавляли in vitro к обогащенной тромбоцитами плазме крови здоровых доноров в концентрации 10-3 Моль/л. Определяли и анализировали параметры агрегации, полученные в течение 5 минут при исследовании спонтанной и стимулированной агрегации тромбоцитов. В качестве индукторов агрегации использовали аденозиндифосфат (АДФ) 0,5х10-5М (2,5 мкг/мл) (ООО «Технология-Стандарт», Россия) и коллаген (20 мг/мл) (ООО «Технология-Стандарт», Россия) [8; 9].
Полученные агрегатограммы анализировали с использованием программного обеспечения AGGR. Параметры агрегации оценивали по кривой среднего размера агрегатов и по кривой светопропускания, учитывая общий характер агрегации (полная, неполная, обратимая, необратимая, одноволновая, двухволновая). По кривой светопропускания определяли максимальное приращение светопропускания после добавления индуктора в процентах - степень агрегации максимальную – Level max (L max) (%), а также максимальный наклон кривой светопропускания в процентах в минуту - скорость агрегации максимальную Velocity max (V max) (%/мин.)
По кривой среднего размера агрегатов определяли максимальное значение среднего размера агрегатов - Level max (Lmax) в относительных единицах (отн. ед.), характеризующее максимальную степень агрегации тромбоцитов и максимальный угол наклона кривой Velocity max (V max) в относительных единицах в минуту (отн. ед./мин.), определяющий максимальную скорость агрегации [10].
Результаты исследования обработаны статистически с помощью стандартного пакета программ Microsoft Office Excel 2007. Проверку на нормальность распределения фактических данных проводили с помощью критерия Шапиро - Уилка. Результаты представлены медианой и межквартильными интервалами. Дисперсионный анализ проводили с помощью критерия Краскела - Уоллиса. Критический уровень значимости р для статистических критериев принимали равным 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
При анализе спонтанной агрегации было выявлено достоверное по сравнению с контролем увеличение на 127% величины степени светопропускания при введении исследуемого соединения ЛХТ 5-10 в кювету агрегометра с обогащенной тромбоцитами плазмой за 10 минут до начала исследования. Введение препарата сравнения этамзилата также приводило к достоверному увеличению степени светопропускания на 127% по сравнению с контролем. При этом скорость агрегации по кривой светопропускания существенно не менялась при введении в кювету соединения ЛХТ 5-10, так же как и этамзилата.
На следующем этапе в кювету с ОТП, кроме ЛХТ 5-10 и этамзилата, вводили активаторы тромбоцитов. АДФ – мощный индуктор агрегации, который увеличивает содержание кальция в цитоплазме тромбоцита, изменяет его форму и тем самым повышает его готовность к адгезии и агрегации. При проведении АДФ-индуцированной агрегации с исследуемым веществом ЛХТ 5-10 было отмечено достоверное увеличение тромбоцитарных агрегатов на 23,3% по сравнению с контролем и ускорение степени агрегации по кривой светопропускания на 16,5%.
При введении индуктора агрегации АДФ в кювету с этамзилатом также было выявлено достоверное увеличение степени и скорости светопропускания соответственно на 27,6% и 20,7% по сравнению с контролем. Таким образом, было установлено, что величины степени и скорости агрегации тромбоцитов после введения АДФ у исследуемого соединения ЛХТ 5-10 и этамзилата являются сопоставимыми.
Коллаген - сильный стимулятор тромбоцитов, находящийся в субэндотелии сосудов и высвобождающийся при его повреждении. Оценка агрегации тромбоцитов, индуцированной коллагеном, показала, что введение ЛХТ 5-10 в кювету агрегометра не приводило к увеличению степени светопропускания и не оказывало влияния на скорость агрегации по кривой светопропускания. Введение препарата сравнения этамзилата в кювету с ОТП также не выявило достоверных изменений коллаген-индуцированной агрегации (табл. 1, 2).
Таблица 1
Значения показателей агрегации тромбоцитов по кривой светопропускания при добавлении ЛХТ 5-10 и этамзилата в кювету с плазмой, обогащенной тромбоцитами in vitro
|
Вид агрегации |
Контроль Плазма обычная+ NaCl |
Плазма+ ЛХТ 5-10, 10-3 М/л |
Плазма+ Этамзилат, 10-3 М/л |
|
Максимальная степень агрегации, Lmax, % |
|||
|
Спонтанная агрегация |
1,5 (1,1-2,3) |
3,4 (2,8-5,4) * |
3,4 (2,9-4,1) * |
|
АДФ-индуцированная агрегация 0,5х10-5 М (2,5 мкг/мл) |
39,5 (32,8-44,2) |
48,7 (44,3-53,7)* |
50,4 (45,3-55,9) * |
|
Коллаген-индуцированная агрегация (20 мг/мл) |
58,7 (43,8-66,5) |
59,9 (47,5-70,2) |
58,5 (44,4-64,8) |
|
Максимальная скорость агрегации, Vmax, %/мин |
|||
|
Спонтанная агрегация |
1,7 (0,8-3,8) |
2,2 (1,3-4,6) |
2,1 (0,9-3,5) |
|
АДФ-индуцированная агрегация 0,5х10-5 М (2,5 мкг/мл) |
50,3 (45,1-54,3) |
58,6 (55,6-63,2)* |
60,7 (56,5-66,1) * |
|
Коллаген-индуцированная агрегация (20 мг/мл) |
56,8 (28,5-79,1) |
48,7 (26,8-68,2) |
48,8 (24,8-74,1) |
Примечания: в таблице представлены медиана и межквартильный интервал (n=10),
* - различия с контролем достоверны (p˂0,05).
Таблица 2
Изменение спонтанной, АДФ-индуцированной и коллаген-индуцированной агрегации тромбоцитов под влиянием ЛХТ 5-10 и этамзилата in vitro
|
Показатели |
Изменение спонтанной агрегации, % к контролю |
Изменения АДФ-индуцированной агрегации, % к контролю |
Изменение коллаген-индуцированной агрегации, % к контролю |
|
ЛХТ 5-10, 10-3 Моль/л |
|||
|
Lmax, % |
127% * |
23,3% * |
-2% |
|
Vmax, %/мин. |
29,4% |
16,5%* |
-14,3% |
|
Этамзилат, 10-3 Моль/л |
|||
|
Lmax, % |
127%* |
27,6%* |
-0,3% |
|
Vmax, %/мин. |
23,5% |
20,7%* |
-14,1% |
Примечание: * - различия с контролем достоверны (p˂0,05).
Таким образом, было установлено, что исследуемое вещество с лабораторным шифром ЛХТ 5-10 (в концентрации 10-3 Моль/л) проявляет проагрегантную активность in vitro, сопоставимую с показателями проагрегантной активности препарата сравнения этамзилата (в концентрации 10-3 Моль/л) по степени агрегации тромбоцитов при спонтанной агрегации, но при этом не влияет на скорость образования тромбоцитарных агрегатов, что также сравнимо с действием этамзилата. Вещество ЛХТ 5-10 достоверно усиливает (23,3%) и ускоряет АДФ-индуцированную агрегацию (16,5%) по сравнению с контролем, но не влияет на степень и скорость коллаген-индуцированной агрегации. Этамзилат также оказывает положительное влияние на степень (27,6%) и скорость (20,7%) АДФ-индуцированной агрегации. При введении активатора тромбоцитов - коллагена, значимых эффектов влияния на агрегацию этамзилата (в концентрации 10-3 Моль/л) найдено не было.
Полученные результаты позволяют рекомендовать новое производное гидрохинонсульфокислоты ЛХТ 5-10 для дальнейшего изучения in vivo и рассматривать его как потенциальное вещество для создания препаратов для лечения заболеваний, связанных с патологией свертывающей системы крови.
Выводы
- Исследуемое вещество под лабораторным шифром ЛХТ 5-10 и препарат сравнения этамзилат при спонтанной агрегации in vitro достоверно увеличивали степень агрегации тромбоцитов в 2,3 раза, влияния на скорость агрегации отмечено не было.
- Под влиянием ЛХТ 5-10 (10-3 Моль/л) происходило достоверное увеличение тромбоцитарных агрегатов в 1,2 раза и ускорение их образования в 1,2 раза при введении индуктора агрегации АДФ (0,5х10-5 М (2,5 мкг/мл)). При введении этамзилата АДФ-индуцированная агрегация тромбоцитов также усиливалась в 1,3 раза и ускорялась в 1,2 раза.
- Достоверных изменений коллаген-индуцированной агрегации (20 мг/мл) под влиянием исследуемого вещества ЛХТ 5-10 и этамзилата отмечено не было.