Несмотря на снижение заболеваемости сифилисом в Российской Федерации, ее уровень по-прежнему остается высоким и превышает показатели развитых европейских стран и США [1; 2]. Особенности сифилитической инфекции в последнее десятилетие определяются увеличением персистирующих скрытых и поздних форм заболевания, частым формированием серорезистентности, сложностями диагностики и терапии вследствие неоправданно широкого использования антибактериальных средств, приводящих к формированию иммунной компрометированности и изменяющих клинику и течение инфекционного процесса [1-4].
Перспективным направлением современной медицины является поиск информативных биомаркеров персистенции инфекции и прогрессирования заболевания, позволяющих прогнозировать сценарий инфекционного процесса и своевременно осуществлять терапевтические мероприятия [5].
Актуальными для изучения при сифилисе являются рецепторы врожденного иммунитета (TLR) [6-9]. Установлено, что нарушение структуры и функции рецепторов TLR сопровождается снижением продукции ключевых интерлейкинов, обеспечивающих интенсивность реакций врожденного и адаптивного иммунитета, что лежит в основе развития инфекционного процесса [7-9].
Частоты полиморфных генов, влияющих на реализацию иммунного ответа, остаются постоянными в течение жизни и могут использоваться в качестве предикторов развития заболевания и реализации его клинических фенотипов [5].
Цель исследования: определение клинико-патогенетической роли TLR-рецепторов в развитии скрытого сифилиса и формировании серорезистентности.
Материал и методы исследования
Иммуногенетические исследования выполнены у 100 человек с сифилитической инфекцией, восточнославянской популяции Юга России, находившихся под наблюдением в Ставропольском краевом клиническом кожно-венерологическом диспансере (СККВД). В группу I включены 35 пациентов с ранним скрытым сифилисом, в группу II – 24 пациента с поздним скрытым сифилисом, в группу III – 41 пациент с сифилисом с серорезистентностью.
Средний возраст у пациентов в группе I составил 35,2±1,8 года, в группе II – 40,9 ±2,09 года, в группе III – 41,1 ±1,74 года.
Контрольную группу составили 50 здоровых жителей восточнославянской популяции Южного региона России, средний возраст – 37,1±1,44 года. Группы пациентов, больных сифилисом и контрольная группа имели близкий социально-экономический статус.
Типирование SNPs TLR2 и TLR6 осуществляли методом ПДРФ (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов) с выполнением амплификации интересующего участка и последующей обработкой эндонуклеазой рестрикции. В работе использовали диагностические наборы для выявления полиморфизмов в геноме человека методом полимеразной цепной реакции «SNP-экспресс» ООО НПФ «Литех», г. Москва.
Амплификацию проводили с помощью многоканального амплификатора «Терцик» (ООО «ДНК-Технология», Россия). Разделение продуктов амплификации выполняли в 3%-ном агарозном геле методом горизонтального электрофореза с использованием комплекта оборудования BioRad Laboratories, США.
Для статистического анализа данных использовали пакет программ Attestat 10.5.1., Statistica SPSS, «Калькулятор для расчета статистики».
Достоверность различий в частотах аллельных вариантов и генотипов оценивалась с помощью критерия χ2 Пирсона, при множественных сравнениях – с помощью критерия χ2 с поправкой Йетса. Степень риска развития событий оценивали по величине отношения шансов (OR) с расчетом доверительного интервала CI.
Результаты исследования и их обсуждение
При изучении аллелей полиморфизма 753 Arg/Gln (rs5743708) гена TLR2 отмечено частотное преобладание дикого аллеля Arg/753 в гомозиготном состоянии как у больных сифилисом (71%), так и у здоровых респондентов (94%) (табл. 1).
Таблица 1
Распределение частот аллелей и генотипов TLR2 у больных со скрытым сифилисом и сифилисом с серорезистентностью
|
Ген |
Аллели /генотип |
Сифилис |
Контрольная группа |
χ2 |
OR (95% CI) |
|
TLR2 -753
|
Arg |
122/200 (0,61) |
97/100 (0,97) |
p<0,01 |
0,05 (0,015-0,158) |
|
Gln |
78/200 (0,39) |
3/100 (0,03) |
p<0,01 |
20,7 (6,33-67,5) |
|
|
Arg/Arg |
71/100 (0,71) |
48/50 (0,96) |
p<0,01 |
0,10 (0,02-0,45) |
|
|
Arg/Gln |
8/100 (0,08) |
1/50 (0,02) |
|
4,26 (0,52-35,1) |
|
|
Gln/Gln |
21/100 (0,21) |
1/50 (0,02) |
p<0,01 |
13,0 (1,70-90,9) |
p – достоверность различий по сравнению с контрольной группой (критерий χ2 Пирсона),
OR - отношение шансов, CI - 95% доверительный интервал.При этом у пациентов со скрытым сифилисом и сифилисом с серорезистентностью установлено существенное увеличение распространенности редкого аллеля Gln/753 – 78/200 (0,39) (OR=20,7, 95% CI:6,33-67,6) по сравнению со здоровыми донорами – 3/100 (0,03). Следует отметить, что гомозиготное состояние мутантного аллеля Gln/753 у больных с сифилисом встречалось в 10 раз чаще, чем у здоровых респондентов (0, 21 и 0,02, p<0,01).
Выявлено существенное увеличение риска развития скрытого и серорезистентного сифилиса у респондентов гомозиготного Gln/Gln и гетерозиготного Arg/Gln генотипов TLR2 –753 Arg/Gln (rs5743708). Относительный риск развития заболевания у носителей Gln/Gln составил 13,0 (95% CI:1,70-90,0), у резидентов Arg/Gln – 4,26 (95% CI:0,52-35,1).
У пациентов с различными клиническими вариантами заболевания установлено достоверное уменьшение частоты преобладающего в популяции аллеля Arg/753 и увеличение мутантного – Gln/753 (табл. 2).
Риск развития заболевания у обладателей Gln/753 при раннем скрытом сифилисе составил 8,1 (95% CI:2,23-29,4), при позднем скрытом – 7,46 (95% CI:1,92-23,0), у пациентов с формированием серорезистентности увеличивался в десятки раз – 65,8 (95% CI:19,1-227,1).
Среди больных со скрытым и серорезистентным сифилисом установлено уменьшение частоты встречаемости гомозигот по основному аллелю (Arg/Arg) по сравнению с контрольной группой. У больных сифилисом с формированием серорезистентности определялось частотное преобладание гомозигот по мутантному аллелю Gln/Gln (0,27 и 0,02, p<0,05).
Таблица 2
Распределение частот аллелей и генотипов гена TLR2 у больных со скрытым сифилисом и сифилисом с серорезистентностью
|
Аллели /генотип |
Ранний скрытый сифилис (I) n=35 |
Поздний скрытый сифилис (II) n=24 |
Серорезис-тентный сифилис (III) n=41 |
Контрольная группа (IV) n=50 |
χ2 |
OR (95% CI) |
|
Arg |
56/70 (0,80) |
39/48 (0,81) |
55/82 (0,67) |
97/100 (0,97) |
pI-IV <0,01 pII-IV <0,01 pIII-IV<0,01 |
0,12 (0,03-0,45)1 0,13 (0,03-0,5202 0,02 (0,004-0,05)3 |
|
Gln |
14/70 (0,20) |
9/48 (0,19) |
27/82 (0,33) |
3/100 (0,03) |
pI-IV <0,01 pII-IV <0,01 pIII-IV<0,01 |
8,1 (2,23-29,4)1 7,46 (1,92-23,0)2 65,8 (19,1-227,1)3 |
|
Arg/Arg |
27/35 (0,77) |
19/24 (0,79) |
25/41 (0,61) |
48/50 (0,96) |
pI-IV <0,05 pII-IV <0,05 pIII-IV<0,05 |
0,14 (0,03-0,71)1 0,16 (0,03-0,89)2 0,07 (0,01-0,31)3 |
|
Arg/Gln |
2/35 (0,06) |
1/24 (0,04) |
5/41 (0,12) |
1/50 (0,02) |
|
2,97 (0,26-34,1)1 2,13 (0,13-35,6)2 6,81 (0,76-60,8)3 |
|
Gly/Gln |
6/35 (0,17) |
4/24 (0,17) |
11/41 (0,27) |
1/50 (0,02) |
pIII-IV<0,05 |
10,2 (1,16-88,5)1 9,8 (1,03-93,2)2 17,9 (2,21-146,3)3 |
p – достоверность различий по сравнению с контрольной группой (критерий χ2 с поправкой Йетса),
OR - отношение шансов, CI - 95% доверительный интервал.
Степень риска развития скрытого сифилиса и сифилиса с серорезистентностью у носителей гомозиготного генотипа полиморфизма TLR2 –753 Arg/Arg (rs5743708) оказалась крайне низкой. Вероятность реализации раннего скрытого сифилиса у гетерозигот Arg/Gln была равной 2,97 (95% CI:0,26-34,1), позднего скрытого – 2,97 (95% CI:0,26-34,1), сифилиса с серорезистентностью – 6,81 (95% CI:0,76-60,8).
Наиболее высокой оказалась вероятность развития сифилитического процесса у гомозигот по дикому аллелю Gln/Gln, при раннем скрытом сифилисе OR=10,2 (95% CI:1,16-88,5), при позднем скрытом – 9,8 (95% CI:1,03-93,2), при сифилисе с серорезистентостью – 17,9 (95% CI:1,21-146,3).
Ранее было показано, что полиморфизм TLR2 Arg753Gln связан с повышенным риском туберкулеза, а также высокой вероятностью развития инфекционного эндокардита, стафилококковой инфекции и проказы [9-11].
Работы по исследованию генного полиморфизма rs5743708 (Arg753Gln) при сифилисе единичны. Полученные нами результаты согласуются с результатами C.M. Marra et al. (2014), свидетельствующими о преобладании пациентов с генотипом TLR2_2258GA в группах с клинически манифестным или асимптомным нейросифилисом [12].
Значение TLR2 при сифилитической инфекции была подтверждено в экспериментальных исследованиях, свидетельствующих о том, что однонуклеотидные мутации TLR2 способны уменьшать активацию макрофагов при взаимодействии с антигеном бледной трепонемы TpN47 [12].
Ранее было установлено, что исследуемый участок Arg753Gln расположен в пределах TIR-домена рецептора TLR2, локализующегося в цитозоле, и его конфигурация влияет на развитие инфекций [7; 11; 12].
Анализ распределения аллелей и генотипов полиморфизма TL6 – 249 Ser/Pro (rs5743810) не выявил достоверных отличий в распространенности дикого Ser/249 и мутантного Pro/249 аллелей у пациентов со скрытым и серорезистентным сифилисом (табл. 3).
Однако вероятность развития заболевания увеличивалась у резидентов аллеля Ser/. Относительный риск развития сифилиса для обладателей гетерозиготного генотипа Pro/Ser был равным 1,34 (95% CI: 0,67-2,70), для резидентов гомозиготного Ser/Ser – 2,07 (95% CI: 0,78-5,49).
Таблица 3
Распределение частот аллелей и генотипов TLR6 у больных со скрытым сифилисом и сифилисом с серорезистентностью
|
Ген |
Аллели /генотип |
Сифилис |
Контрольная группа |
χ2 |
OR (95% CI) |
|
|
Ser |
83/200 (0,42) |
30/100 (0,3) |
|
1,65 (0,99-2,76) |
|
Pro |
117/200 (0,58) |
70/100 (0,7) |
|
0,60 (0,36-1,00) |
|
|
Ser/Ser |
22/100 (0,22) |
6/50 (0,12) |
|
2,07 (0,78-5,49) |
|
|
Pro/Ser |
43/100 (0,43) |
18/50 (0,36) |
|
1,34 (0,67-2,70) |
|
|
Pro/Pro |
35/100 (0,35) |
26/50 (0,52) |
p<0,05 |
0,50 (0,25-0,99) |
p – достоверность различий по сравнению с контрольной группой (критерий χ2 Пирсона),
OR - отношение шансов, CI - 95% доверительный интервал.
При этом наблюдалось достоверное уменьшение распространенности гомозиготного генотипа Pro/Pro у пациентов со скрытым сифилисом и сифилисом с серорезистентностью (0,35 и 0,52, p<0,05).
У пациентов с развитием серорезистентности чаще, чем у здоровых респондентов, определялось носительство дикого аллеля Ser/249 (0,46 и 0,30, p<0,05), реже мутантного – Pro/249 (0,54 и 0,70, p<0,05). Менее распространенным оказался и гомозиготный по мутантному аллелю генотип Pro/Pro (0,27 и 0,52, p<0,05) (табл. 4).
При раннем скрытом сифилисе редко определялся гетерозиготный вариант Ser/Pro. Однако гетерозигот Ser/Pro оказалось существенно больше среди пациентов с поздним скрытым сифилисом и сифилисом с серорезистентностью, для этих пациентов степень риска развития заболевания составила 2,10 (95% CI: 0,78-5,65) и 2,06 (95% CI: 0,89-4,78) соответственно.
Таблица 4
Распределение частот аллелей и генотипов гена TLR6 у больных со скрытым сифилисом и сифилисом с серорезистентностью
|
Аллели /генотип |
Ранний скрытый сифилис (I) n=35 |
Поздний скрытый сифилис (II) n=24 |
Серорезис-тентный сифилис (III) n=41 |
Контрольная группа (IV) n=50 |
χ2 |
OR (95% CI) |
|
Ser |
24/70 (0,34) |
21/48 (0,44) |
38/82 (0,46) |
30/100 (0,3) |
pIII-IV<0,05 |
1,22 (0,63-2,30)1 1,82 (0,89-3,20)2 2,01 (1,10-3,71)3 |
|
Pro |
46/70 (0,66) |
27/48 (0,56) |
44/82 (0,54) |
70/100 (0,7) |
pIII-IV<0,05 |
0,82 (0,43-1,58)1 0,55 (0,22-1,12)2 0,50 (0,27-9,13)3 |
|
Ser/Ser |
11/35 (0,31) |
3/24 (0,13) |
8/41 (0,19) |
6/50 (0,12) |
|
3,36 (1,11-10,22)1 1,05 (0,24-4,60)2 1,78 (0,56-5,62)3 |
|
Ser/Pro |
8/35 (0,23) |
13/24 (0,54) |
22/41 (0,54) |
18/50 (0,36) |
pI-II <0,05 pI-III<0,05 |
0,53 (0,20-1,40)1 2,10 (0,78-5,65)2 2,06 (0,89-4,78)3 |
|
Pro/Pro |
16/35 (0,46) |
8/24 (0,33) |
11/41 (0,27) |
26/50 (0,52) |
pIII-IV<0,05 |
0,78 (0,33-1,85)1 0,46 (0,17-1,22)2 0,34 (0,14-0,82)3 |
p – достоверность различий по сравнению с контрольной группой (критерий χ2 с поправкой Йетса),
OR - отношение шансов, CI - 95% доверительный интервал.
Гомозиготный генотип Ser/Ser чаще встречался при раннем скрытом сифилисе (OR = 3,36, CI: 1,11-10,22) и сифилисе с серорезистентностью (OR = 1,78, CI: 0,56-5,62).
Известно, что ген TLR6 расположен на длинном плече 13 хромосомы (4р13), кодирует рецептор, состоящий из 796 аминокислот, способный распознавать микробные паттерны грибов и грамположительных бактерий и инициировать активацию фактора транскрипции (NF-kB) посредством адаптерных белков MyD88 и TRAF6 [13]. В результате синтезируются IL1, IL2, IL6, TNFα, имеющие провоспалительный потенциал и стимулирующие иммунный ответ.
В ряде зарубежных публикаций показана связь между SNP TLR6 и развитием инфекционного процесса. Выявлено, что SNP T1932G (A644A) коррелирует с измененной секрецией IF? в ответ на стимуляцию мононуклеарных клеток периферической крови вирусом кори [13], тогда как как C745T является фактором риска развития инвазивного аспергиллеза [14].
Установлено, что SNP TL6 –249 Ser/Pro (rs5743810) инициирует высвобождение IF? после введения вакцины BCG [15]. У носителей Ser/Ser установлен низкий уровень IL6, что уменьшает интенсивность иммунного ответа.
Выводы
- Полиморфизмы генов врожденного иммунитета TLR2 Arg753Gln (rs5743708), TLR6 Ser249Pro (rs5743810) ассоциированы с развитием скрытых форм сифилиса и сифилиса с серорезистентностью у пациентов Юга России.
- Молекулярно-генетическими маркерами повышенного риска развития скрытых форм сифилиса и сифилиса с серорезистентностью являются генотипические варианты 753 Arg/Gln и 753 Gln/Gln, 249 Pro/Pro, а также наличие аллелей Gln/753, Pro/249. Протективными свойствами обладают гомозиготные генотипы TLR2-753 Arg/Arg, TLR6 –249 Pro/Pro и аллель Pro/249.
- Факторами риска развития серорезистентности при сифилисе является носительство аллелей Gln/753, Pro/249 и генотипов 753 Arg/Gln и 753 Gln/Gln, 249 Pro/Pro.