Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

MOLECULAR CYTOGENETIC AND BIOINFORMATIC RESEARCH: DELETION OF CHROMOSOME 6 (6q22.1-q23.2) AND POTENTIAL OF INTERACTOME ANALYSIS

Yurov I.Yu. 1, 2, 3 Vorsanova S.G. 2, 1 Demidova I.A. 2, 1 Vasin K.S. 1, 2 Shmitova N.S. 1 Yablonskaya M.I. 2 Gordeeva M.L. 2 Yurov Yu.B. 1, 2
1 Mental Health Research Center, RAMS, Moscow
2 Academician Yu.E. Veltishchev Research Clinical Institute of Pediatrics, N.I. Pirogov Russian National Research Medical University, Ministry of Health of the Russian Federation
3 FSBEI FPE «Russian Medical Academy of Postgraduate Education» of the Ministry of Health of the Russian Federation
Here, we present a clinical, cytogenetic, molecular cytogenetic and bioinformatic evaluation of 6q22.1q23.2 deletion. We provide a detailed analysis of the genes affected by this chromosomal abnormality and discuss the effect on the phenotype. Bioinformatic (in silico) technology, aimed at gene prioritizing and uncovering candidate processes through filtering and ranking strategies, is performed using interactome databases. Among the deleted genes, the most prominent pathogenetic role was attributed to GJA1, which is associated with oculodentodigital dysplasia. Since functional and morphological abnormalities similar to the disease have been observed in a presented girl, we conclude the key role of GJA1 in the phenotype development. Epilepsy was attributed to NUS1 loss, which has already been associated with this condition. Interactome analysis suggests that intellectual disability is associated with the deletion of several protein coding genes forming single interactome. The index case demonstrates the necessity of combining cytogenetic and molecular cytogenetic techniques with bioinformatic analysis for uncovering mechanisms of phenotype formation and for genotype-phenotype correlations.
deletion of chromosome 6
molecular karyotyping
bioinformatic technology in silico

Частота умственной отсталости, аутизма, эпилепсии у детей широко варьирует и, по различным данным, может превышать 3% в общей популяции [1-5]. Этим заболеваниям нередко сопутствуют врожденные пороки и/или микроаномалии развития. В случае отсутствия экзогенных факторов, негативно влияющих на формирование центральной нервной системы (ЦНС), возникновение данного нарушения, как правило, связывают с генетическими нарушениями. При наличии признаков нервного и/или психического расстройств для выявления генетических факторов заболевания применяются различные методы диагностики. К последним можно отнести цитогенетический анализ и молекулярное кариотипирование (серийную сравнительную геномную гибридизацию - arrayCGH). Разрешающая способность цитогенетического исследования составляет 5 и более млн пн, в то время как молекулярное кариотипирование позволяет выявлять хромосомные микроаномалии размером от 500 пн [6-8]. В российских когортах детей с нарушением психики и пороками развития геномная патология выявляется примерно в половине случаев, из которых 8-12% определяют классическим кариотипированием и до 40% - молекулярно-цитогенетическими методами [9]. В остальных случаях причину патологии, как правило, выявить не удается. Это связано с тем, что нервные и психические заболевания могут быть связаны с генными мутациями, не выявляемыми указанными методами.

Интерпретация геномных аномалий, выявленных молекулярно-цитогенетическими методами, как правило, требует применения методов биоинформатики. Наследование многих психических заболеваний носит полигенный характер, а их проявления варьируют в зависимости от функций и числа затронутых генов в сочетании с индивидуальными генетическими особенностями. Помимо патогенных геномных нарушений, ассоциированных с различными заболеваниями, в популяции присутствует большое количество рекуррентных или часто встречающихся перестроек, считающихся непатогенными [10]. Однако если несколько рекуррентных нарушений затрагивают одну интерактомную сеть, то в результате кумулятивного эффекта они могут создать основу для развития заболевания. Данные молекулярного кариотипирования позволяют уточнить локализацию нарушения и идентифицировать гены, ассоциированные с обнаруженной микроаномалией. Затем, используя биоинформатический анализ, можно оценить вовлеченность в патогенез каждого гена, сделать предположение о процессах или каскаде процессов, лежащих в основе развития заболевания. Анализ фенотипических и патофизиологических нарушений способствует поиску эффективных способов коррекции нарушений, вызванных генетическими аномалиями.

В данной работе мы представляем клиническую, цитогенетическую и молекулярно-цитогенетическую характеристику делеции длинного плеча хромосомы 6 в участке 6q22.1q23.2 у ребенка 5 лет. Приведен детальный анализ генов, локализованных в области аномалии, с обсуждением корреляции генотип-фенотип.

Цель работы

Цель настоящей работы заключалась в описании молекулярно-цитогенетических и биоинформатических исследований хромосомной патологии у ребенка с умственной отсталостью и врожденными пороками развития на основе применения анализа геномных вариаций и их функциональных последствий.

Материалы и методы

Цитогенетическое исследование. Препараты метафазных хромосом получали путем фиксации лимфоцитов периферической крови, после культивирования in vitro в соответствии со стандартной методикой. Цитогенетический анализ проводился при помощи дифференциального окрашивания хромосом по длине (G- и C-окрашивание) по общепринятым протоколам [3] под световым микроскопом при увеличении х1125.

Молекулярно-цитогенетическое исследование. Подготовка ДНК и анализ методом молекулярного кариотипирования проводили согласно ранее описанному протоколу с использованием SNP/олигонуклеотидной микроматрицы c разрешением не менее 1 тысячи пн (Affymetrix) [3-5].

Биоинформатический анализ. Изучение транскриптомных, метаболомных и интерактомных данных проводили с использованием оригинальной биоинформатической технологии [11; 12]. Межбелковые взаимодействия оценивались с использованием ресурса Mentha [13].

Результаты и обсуждение

В лабораторию молекулярной цитогенетики нервно-психических заболеваний была направлена девочка 5 лет с задержкой психоречевого развития и эпизодами фебрильных судорог для исследования кариотипа. Ребенок родился от 2-й беременности, нормальных родов. Беременность протекала с гестозом в первом триместре, повышенным артериальным давлением и угрозой прерывания. Масса ребенка при рождении составила 2800 г, рост - 50 см. Раннее моторное развитие ребенка протекало с отставанием: сидеть стала с 9 месяцев, ходить с - 1 года 11 месяцев. Фразовая речь появилась с трех лет. Первый эпизод фебрильных судорог произошел в 1 год и 3 месяца. У пациентки есть старший брат, развивающийся нормально.

При обследовании врачом-генетиком у ребенка были выявлены следующие микроаномалии развития: долихоцефалия, тонкие редкие волосы, узкое лицо, гипотелоризм глазных щелей, увеличение средней части лица, ретрогнатия, диспластичные ушные раковины, мелкие дистрофичные зубы, тонкие ногти, брахидактилия. Отмечалась умеренная мышечная гипотония, кифоз в грудном отделе позвоночника. В анамнезе наблюдались хореиформные гиперкинезы в мышцах конечностей, лица, шеи. Ребенку был поставлен диагноз: задержка психоречевого развития, симптоматическая эпилепсия, гиперкинетический синдром и гиперактивность. При магнитно-резонансной томографии (МРТ) была выявлена субатрофическая вентрикуломегалия резидуального характера. Офтальмологом обнаружена ангиопатия сетчатки.

В результате проведенного цитогенетического анализа была обнаружена интерстициальная делеция в длинном плече хромосомы 6 с предполагаемыми точками разрыва (кариотип - 46,ХХ,del(6)(q22.?q23.?3) (рис. 1).

Рис. 1. Результаты цитогенетического исследования: обнаружена делеция хромосомы 6 в предполагаемом участке q22.?q23.?3

Для уточнения точек разрыва делеции и поиска других хромосомных микроперестроек было проведено молекулярно-цитогенетическое исследование методом молекулярного кариотипирования/SNParray. Исследование подтвердило наличие делеции, затрагивающей участок 6q22.1q23.2. Размер её составил 13,7 млн пн (геномные координаты: 117898555-131656086) (рис. 2). Других значимых (патогенных) геномных перестроек обнаружено не было.

Рис. 2. Схематическое изображение делеции хромосомы 6, обнаруженной с помощью молекулярного кариотипирования

Согласно UCSC [14] в области делеции локализовано 66 генов; из них 30 индексированы в базе данных OMIM [15]. В первую очередь, мы рассмотрели гены, ассоциированные с известными заболеваниями: PLN, MCM9, TRDN, LAMA2 и GJA1 (таблица).

Гены, индексированные в OMIM и ассоциированные с известными клиническими проявлениями

Ген

Клинические проявления

Тип наследования

PLN

[OMIM:

172405]

Кардиомиопатия дилатационная, гипертрофическая [OMIM:609909,613874]

Аутосомно-рецессивный

MCM9 [OMIM:

610098]

Дисгенезия яичников [OMIM:616185]

Аутосомно-рецессивный

TRDN [OMIM:

603283]

Желудочковая тахикардия [OMIM:615441]

Аутосомно-рецессивный

LAMA2 [OMIM:

156225]

Врожденная мышечная дистрофия [OMIM:607855]

Аутосомно-рецессивный

GJA1

[OMIM:

121014]

1. Дефекты межпредсердной и межжелудочковой перегородок [OMIM:600309]

Аутосомно-доминантный

2. Краниометафизарная дисплазия [OMIM:218400]

Аутосомно-рецессивный

3. Глазо-зубо-пальцевой синдром [OMIM:164200,257850]

Аутосомно-доминантный и аутосомно-рецессивный

4. Эритрокератодермия [OMIM:133200]

Аутосомно-доминантный и аутосомно-рецессивный

5. Синдактилия, 3 типа [OMIM:186100]

Аутосомно-доминантный

 

Согласно базе данных генетических заболеваний - OMIM, нарушения генов PLN [OMIM:172405] и TRDN [OMIM:603283] приводят к сердечной патологии с рецессивным типом наследования. Сердечной патологии у ребенка выявлено не было. Однако нельзя исключить проявление заболеваний сердца в более позднем возрасте. Нарушения гена MCM9 [OMIM;610098] приводят к дисгенезии яичников с аутосомно-рецессивным типом наследования. Возраст девочки не позволяет рассматривать ассоциацию делеции этого гена с соответствующими его мутации фенотипическими проявлениями. Данные об ассоциации генов PLN, TRDN и MCM9 с нервной и психической патологией отсутствуют.

Учитывая фенотип ребенка, интерес представляют 2 других гена, индексированных в OMIM и локализованных в области делеции, это гены: LAMA2 и GJA1. Нарушения гена LAMA2 [OMIM:156225] вызывают врожденную мышечную дистрофию. Заболевание имеет рецессивный тип наследования и проявляется в виде тяжелой врожденной мышечной дистрофии. Помимо мышечной слабости, характерным изменением является расширение желудочков мозга. Иногда наблюдается умственная отсталость и судороги. У обследуемого ребенка отмечаются мышечная гипотония и задержка психоречевого развития. Исследование с помощью МРТ выявило вентрикуломегалию. Учитывая аутосомно-рецессивный тип наследования, делеция одной копии гена LAMA2 не должна приводить к развитию патологического фенотипа ребенка. Однако такую возможность нельзя исключить в случае, если имеющаяся копия гена содержит нарушения.

Согласно базе данных ОMIM, нарушения гена GJA1 [OMIM:121014] вызывают глазо-зубо-пальцевой синдром [OMIM:164200], известный также как окуло-денто-дигитальная дисплазия. Это генетическое заболевание характеризуется высокой пенетрантностью и широкой фенотипической вариабельностью.

В работе Paznekas с соавторами [16] было описано более 240 пациентов с глазо-зубо-пальцевым синдромом. Типичными черепно-лицевыми аномалиями, характерными для данного синдрома, являются микроцефалия, тонкие гипопластические крылья носа, выраженная носовая перегородка. К другим скелетным аномалиям при данном синдроме относятся черепной гиперостоз, челюсть с высоким альвеолярным гребнем, ретрогнатия верхней и нижней челюстей и широкие трубчатые кости. В большинстве случаев у больных наблюдаются такие аномалии строения зубов, как микродонтия, частичная анодонтия, гипоплазия эмали, множественный кариес и ранняя потеря зубов, а также хрупкие ногти и аномалии волос (гипотрихоз, медленный рост) [17-18]. Микроаномалии конечностей при глазо-зубо-пальцевом синдроме включают: синдактилию третьего, четвертого и пятого пальцев рук, и второго, третьего, четвертого пальцев ног, камптодактилию, клинодактилию, возникающую из-за гипоплазии или аплазии средних фаланг пальцев. К офтальмологическим нарушениям относятся: недоразвитая роговица и конъюнктива, мелкопористый хрусталик, катаракта, глаукома и атрофия зрительного нерва. В некоторых случаях отмечаются диспластичные ушные раковины и нарушения слуховой проводимости. К неврологическим проявлениям глазо-зубо-пальцевого синдрома относятся дизартрия, неврологические расстройства мочеиспускания, судорожные параличи, атаксия, слабость передних большеберцовых мышц и судороги [19]. Симптомы спастического мочевого пузыря или нарушения походки являются обычными неврологическими проявлениями, особенно заметными к возрасту 20 лет. На МРТ головного мозга больных, как правило, определяются диффузные билатеральные аномалии подкоркового белого вещества, которые можно определить, как результат медленно прогрессирующей лейкодистрофии.

Из вышеперечисленных симптомов в литературных источниках у представленного ребенка присутствуют следующие клинические проявления: ретрогнатия, мелкие дистрофичные зубы, тонкие ногти, тонкие редкие волосы, диспластичные ушные раковины, брахидактилия, эпилептические приступы. Со стороны зрения характерных проявлений нет, но была выявлена ангиопатия сетчатки, которая может впоследствии приводить к катаракте и глаукоме. На МРТ обнаружены изменения в виде дилатации желудочков, которые могут быть признаком лейкодистрофии.

Ген GJA1 кодирует белок коннексин 43. Коннексины являются субъединицами межклеточных контактов, которые непосредственно связывают цитоплазму соседних клеток и осуществляют транспорт небольших ионов и сигнальных молекул (<1 кДа), затрагивая все системы организма. Межклеточные коммуникации играют значимую роль в дифференцировке клеток и регуляции роста. Разнообразие белков семейства коннексинов обеспечивает разнообразие межклеточных контактов и их свойств. Ген GJA1 имеет повышенную экспрессию в стволовых клетках эмбриона, плюрипотентных стволовых клетках, гладкой мускулатуре, кератиноцитах и остеобластах. В ЦНС коннексин 43 является важным белком астроцитов и эпендимоцитов, но не экспрессируется на олигодендроцитах и нейронах. По данным литературы, делеция одной копии гена коннексина не приводит к развитию патологического фенотипа [20-21]. Потеря двух аллелей гена GJA1, напротив, имеет негативные последствия, и другие гены семейства коннексинов не в силах компенсировать потерю. У описываемого ребёнка из-за делеции имеется только одна копия гена GJA1, поскольку в фенотипе ребенка присутствуют черты окуло-денто-дигитальной дисплазии, можно предположить, что в единственной копии гена имеются нарушения. Помимо генов, ассоциированных с патологией и описанных выше, делеция затрагивает еще 61 ген, вариации которых, возможно, могут вносить вклад в фенотип представленного ребенка.

Первый эпилептический приступ у девочки произошел в возрасте 1 года, а в дальнейшем был поставлен диагноз криптогенной генерализованной эпилепсии. Мы провели анализ литературных данных по ассоциациям нарушений данного участка и эпилепсии. Действительно, в нескольких работах описана ассоциация интерстициальной делеции хромосомы 6 (6q22q24) и эпилепсии с фебрильно-провоцируемыми приступами при доминантном типе наследования с высокой пенетрантностью и ранней манифестацией. В дальнейших исследованиях участок, отвечающий за различные эпилептические проявления, был сужен до 7,6 млн пн с геномной локализацией в 6q22.1q22.31 (насчитывает 18 генов, индексированных в OMIM). Кроме того, можно предположить, что этот участок может включать новые локусы предрасположенности к идиопатической генерализованной эпилепсии.

В другой работе авторы описали 6 неродственных пациентов с разными делециями внутри участка 6q21q22.31 и установили, что его потеря приводит к задержке психического и речевого развития, ухудшению когнитивных функций, эпилепсии и треморам различной интенсивности [22]. Приступы судорог наблюдались у 3 из 6 пациентов, что совпадает с другими опубликованными данными о возможной неполной пенетрантности генов предрасположенности к эпилепсии при делеции 6q22 [23-24]. Далее исследователи сузили область анализа хромосомы до сегмента величиной 250000 пн в участке 6q22.1. В этой области локализован ген NUS1. Анализ транскрипции генов показал, что NUS1 экспрессируется в мозге. NUS1 кодирует субъединицу мембранного рецептора NgBR, который взаимодействует с регуляторами роста и подвижности нейронов [25]. Исходя из приведенных данных, эпилептические проявления у ребенка могут быть связаны непосредственно с геном NUS1.

Анализ экспрессии генов

Одним из основных параметров при приоритизации генов-кандидатов, нарушения в которых могут приводить к развитию нервных и психических заболеваний, является экспрессия генов в соответствующих тканях. Ранжирование и «фильтрация» генов проводится по уровню их экспрессии в клетках различных тканей. В ходе оценки данных экспрессии 66 генов, входящих в делетированный участок, путём анализа базы данных BiоGРS [26] было установлено, что повышенную экспрессию в различных областях головного мозга имеют 10 генов: GJA1, AKAP7, EPB41L2, FABP7, FAM184A, HDDC2, NKAIN2, PTPRK, SERINC1 и TPD52L1 (рис. 3). Из них гены GJA1, RNF146, SERINC1, TPD52L1 имеют повышенную экспрессию в префронтальной области коры головного мозга.

Рис. 3. Экспрессия генов в различных областях мозга (по оси абсцисс гены AKAP7, EPB41L2, FABP7, FAM184A, GJA1, HDDC2, NKAIN2, PTPRK, SERINC1, TPD52L1, уровень экспрессии генов по оси ординат в баллах)

Гены AKAP7, FABP7, NKAIN2, PTPRK характеризуются высокой экспрессией при формировании мозга эмбриона. Нарушение их функции может сказываться на дифференцировке нейронов, что в свою очередь может приводить к общему снижению когнитивной функции и к умственной отсталости. В литературе, однако, информация о нарушениях генов AKAP7, FABP7, NKAIN2, PTPRK отсутствует.

Интерактомный анализ

Был проведён интерактомный анализ (изучение межбелковых взаимодействий) продуктов транскрипции генов, находящихся в области делеции. На рисунке 4 представлена схема взаимодействий белков, кодируемых генами, входящими в область делеции. Схема была смоделирована с использованием онлайн-ресурса [13]. В ходе анализа были выделены две интерактомные сети, представляющие интерес для дальнейшей «фильтрации» процессов-кандидатов (рис. 4).

Рис. 4. Схематическое изображение взаимодействий между белками, ассоциированными с генами, локализованными в области делеции (обозначены синим цветом), и другими белками клетки (обозначены зеленым цветом)

Белки EPB41L2, TPD52L1, имеющие повышенную экспрессию в клетках головного мозга, и белок KIAA0408 взаимодействуют с 5 белками (YWHAQ, YWHAZ, YWHAB, YWHAG, SNF), которые относятся к одному классу регуляторных белков семейства 14-3-3[27-28]. Они распознают и специфически взаимодействуют с фосфорилированными аминокислотными остатками белков. Фосфорилирование остатков серина, треонина и тирозина, катализируемое протеинкиназами, является одним из широко распространённых видов посттрансляционных модификаций, влияющих на структуру и свойства белка. Эти белки задействованы в целом ряде значимых биологических процессов, включая регуляцию клеточного цикла, миграцию нейронов, апоптоз, нейрогенез, аксональное наведение и другие процессы в ЦНС. Нарушения этих процессов связывают с патогенезом нервных и психических, а также нейродегенеративных заболеваний [29]. Множество исследований свидетельствуют о связи качественных и количественных нарушений белков семейства 14-3-3 с различными нервными и психическими нарушениями [30].

Другая заслуживающая внимание интерактомная сеть состоит из нескольких белков, кодируемых следующими генами, локализованными в области делеции: EPB41L1, ECHDC1, HINT3, FAM184A, включая белок APP (предшественник бета-амилоида), с которым все вышеперечисленные белки имеют прямое взаимодействие. Экспериментальные данные свидетельствуют о функциональной роли APP в развитии синапсов [31-32]. Нарушение этого белка связывают с развитием одной из форм старческого слабоумия - болезни Альцгеймера. Нарушения в нескольких генах, участвующих в общих клеточных процессах, могут иметь кумулятивный эффект для функционирования целого каскада процессов, в котором они участвуют, что может иметь негативные последствия для ЦНС и организма в целом. Не исключено, что у данного пациента в дальнейшем могут развиться нейродегенеративные нарушения.

Заключение

Представлен уникальный случай интерстициальной делеции длинного плеча хромосомы 6 (q22.1-q23.2), проведён анализ генов, локализованных в этой области, направленный на приоритизацию генов и процессов-кандидатов, ассоциированных с развитием фенотипических проявлений у ребёнка. Ранжирование и «фильтрация» генов проведены по уровню их экспрессии в клетках различных тканей. Среди этих генов наиболее выраженную патогенетическую роль имеет ген GJA1, проявляющийся в виде глазо-зубо-пальцевого синдрома. Похожие функциональные и морфологические нарушения присутствуют у обследованного ребёнка, что позволяет сделать вывод о ключевой роли гена GJA1 в развитии специфического фенотипа. Присутствующие эпилептические проявления, по-видимому, могут быть вызваны делецией гена NUS1, роль которого в развитии эпилепсии доказана. Результаты интерактомного анализа выявили две интерактомные сети, функционирование которых может быть нарушено в результате делеции. Изменения в этих цепях могут приводить к нарушениям функциональной работы мозга.

Представленный случай демонстрирует необходимость применения молекулярно-цитогенетических методов исследования с дальнейшим биоинформатическим анализом с помощью ранжирования и «фильтрации» генов-кандидатов и процессов-кандидатов, приводящих к фенотипическим проявлениям.

Работа поддержана грантами «Российского фонда фундаментальных исследований» (проекты № 17-04-01366А и №16-54-76016 ЭРА_а) и программой фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные исследования для разработки биологических технологий» (ФИМТ) (проекта № ФИМТ-2014-235).