Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,120

SOMATOTROPIC HORMONE AS A MEANS OF IMPROVING IMMUNIZATION PROTECTIVES AGAINST COLIBACTERIOSIS BY КВСLENIUM NANOPARTICLES, CARRIER ANTIGENS ESCHERICHIA COLI

Gabalov K.P. 1 Tarasenko T.N. 1 Galkina O.A. 1 Fomin A.S. 1 Ryumina M.V. 1 Vidyagina O.S. 2 Staroverov S.A. 1, 2 Volkov A.A. 1, 2
1 Federal State Budgetary Scientific Institution Saratov Scientific and Research Veterinary Institute
2 Saratov State Agrarian University Named After N.I. Vavilov
Was carried out an analysis of the use of somatotropic hormone as a means of increasing immunization protectivity against colibacillosis by Escherichia coli antigens in the composition of reduced selenium particles. By a reduction of selenite by sodium thiosulfate in an overnight culture of the vaccine strain Escherichia coli B-5 on selenium broth produced a culture with reduced selenium (CVS). The rabbits were immunized with the obtained CVS, twice with an interval per week. Half of the immunized animals was injected recombinant somatotropic hormone (STH) at a dose of 0.067 mg/kg (0.022 IU/kg) twice daily for the first week of immunization. Immunization of CVS leads to an increase in activity of aspartate aminotransferase (AST) and a decrease in the activity of alanine aminotransferase (ALT) in the blood serum, which is expressed in the growth of values of de Ritis ratio. Immunization of CV with simultaneous injection of STH leads to a decrease in the activity of AST and an increase of ALT activity, which reduces the de Ritis coefficient. Immunization of CVS and CVS together with STH increased the agglutinating capacity of blood serum for E. coli Б-5 cells, but only serum of animals immunized with CVC in conjunction with STH, inhibited the growth of E. coli Б-5 in vitro. Correlation analysis revealed a negative correlation of E. coli B-5 growth in serum with ALT activity irrespective of immunization, the Pearson correlation coefficient was -0.97 (p <0.05). Three weeks after the initiation of rabbit injections, E. coli B-5 was injected intravenously at a dose of LD100. Survival for animals immunized with CVS was 50%, for animals with concomitant STG injections increased to 100%. The use of STH concomitantly with immunization with E. coli B-5 antigens associated with selenium particles increases immunization protectivity. The reason for the growth of immunization protectivity may be, in addition to the immunological effects of immunization, favorable changes in the biochemical homeostasis of the organism. The use of STH in immunization can be promising for the control of colibacillosis.
Escherichia coli
colloidal selenium
immunization

Колибактериоз  - общее название группы инфекций, вызываемых кишечной палочкой Escherichia coli и, реже, другими эшерихиями - E.paracoli, E. fergusonii, вызывающими большую группу разнообразных заболеваний человека и животных [1; 2]. В настоящее время колибактериоз остается одним из серьёзных заболеваний сельскохозяйственных животных [1]. В животноводстве заболевание приводит к значительной гибели молодняка и большим потерям привесов у взрослого поголовья [3].

Широкая распространённость вирулентных штаммов кишечной палочки и разнообразие серологических и токсигенных свойств бактерии осложняет создание универсальной вакцины против данного заболевания [1; 4; 5]. В последние годы в качестве живой вакцины успешно применяется слабовирулентный α-гемолитический штамм E. coli Б-5, иммунизация которым приводит к формированию устойчивого антитоксического иммунитета [6; 7]. Однако использование живых вакцин может быть опасно при иммунодефицитных состояниях и связано с интродукцией в окружающую среду потенциально опасного микроба [5].

Одним из перспективных подходов к профилактике колибактериоза является применение субъединичных вакцин [8; 9; 10]. Для повышения иммуногенности субъединичных вакцин используются различные адъюванты: ланолин, фосфат и гидроксид алюминия, хлорид и фосфат кальция, силикаты, нуклеотиды, полианионы и др. [11]. Перспективным направлением в вакцинологии является использование адъювантных свойств различных наночастиц [12; 13]. Так, для иммунизации против колибактериоза были использованы частицы селена, связанные с антигенами E. coli Б-5, что повышало выживаемость мышей на 50% в сравнении со стандартным формалинизированным анатоксином культуры E. coli Б-5 при летальном заражении [14].

Активность ряда ферментов крови является индикатором иммунологического статуса и биохимического гомеостаза организма животного. К ним относятся такие ферменты, как аспартатаминотрансфераза (АСТ) и креатинкиназа (КК), отражающие интенсивность аэробных процессов окисления, а также аланинаминотрансфераза (АЛТ) и лактатдегидрогеназа (ЛДГ), свидетельствующие о направленности метаболизма [15]. В здоровом организме повышение активности АЛТ свидетельствует об активизации пластических процессов. Повышение активности АСТ свидетельствует о преобладании энергозатратных процессов, в том числе при иммунном ответе организма на внедрение патогена и т.д. КК стимулирует процессы окислительного фосфорилирования в митохондриях [16]. Активность ЛДГ в крови повышается при энергозатратных процессах, требующих восполнения питательных веществ, а соотношение АСТ/ЛДГ отражает соотношение аэробного и анаэробного окисления углеводов [16]. Отношение АСТ/АЛТ, или коэффициент де Ритиса, отражает баланс энергетического и пластического обмена [16]. Для оценки сбалансированности метаболических процессов в организме животного предложен также индекс ферментемии (ИФ): ИФ = АСТ/АЛТ + АСТ/ЛДГ + КК/ЛДГ [15; 17; 18]. Показано, что чем ниже значение ИФ в крови животного, тем выше активность анаболических процессов [15].

Помимо иммуностимулирующего, у любой вакцины имеются побочные эффекты, в частности нарушения метаболического гомеостаза, которые следует учитывать при иммунизации животных [19; 20]. Ранее было показано, что биохимическое состояние макроорганизма сказывается на заражении и исходе бактериального заболевания [15; 16; 18]. Инфицирование цыплят-бройлеров штаммом Е. coli Б-5 приводит к увеличению в крови активности КК, значений коэффициента де Ритиса и ИФ, снижению активности АЛТ и ЛДГ [16]. При инфекционных заболеваниях, вызванных различными токсигенными микроорганизмами, наблюдается повышение ИФ и коэффициента де Ритиса, что обусловлено интенсификацией окислительного фосфорилирования [16]. Повышение активности АСТ в крови иммунизированных животных прямо корреллирует с метаболической активностью лейкоцитов, рост активности КК указывает на защиту клеток от цитолиза [16], т.е. изменение активности ферментов является не только маркером течения инфекционного процесса, но может играть защитно-компенсаторную роль [21].

Для коррекции метаболических эффектов, вызванных вакцинацией, может быть полезно применение модуляторов метаболизма [22]. Одним из возможных усилителей протективного эффекта является соматотропный гормон (СТГ), стимулирующий анаболические процессы [23]. В силу сказанного логично предположение, что коррекция биохимического состояния организма путём введения СТГ параллельно с вакцинацией животных против колибактериоза может приводить к росту протективного эффекта иммунизации и снятию её побочных эффектов.

Цель исследования состояла в оценке повышения протективности иммунизации животных против колибактериоза культурой E.coli Б-5 с восстановленным селеном, несущей клеточные и экстрацеллюлярные антигены, путем одновременного введения соматотропного гормона и выяснении сопутствующих биохимических последствий иммунизации.

Материал и методы исследования. В работе использовали штамм E. coli Б-5 из музея культур Саратовского научно-исследовательского ветеринарного института, применяющийся в качестве вакцинного [7].

Приготовление культуры с восстановленным селеном, несущей клеточные и экстрацеллюлярные антигены E. coli Б-5 (КВС). 10 мл селенитового бульона (НПО «Питательные среды», Россия) инокулировали суточной агаровой культурой E. coli Б-5 (1 млрд КОЕ/мл) и культивировали в течение 18 ч (37 °С). Для восстановления остаточного селенита в культуру вносили 400 мкл 30% тиосульфата натрия до конечной концентрации 1.2% и инкубировали в течение 2 ч (37°С).

Исследование проводили на беспородных кроликах-самцах весом 3,5±0,2 кг, формировали 4 группы животных по 6 голов. Животных одной группы иммунизировали КВС в дозе 0.1 мл/кг веса, подкожно, двукратно с интервалом в неделю (группа «КВС»); другим подкожно вводили СТГ в дозе 0,067 мг/кг (0,022 ЕМ/кг), 2 раза в день в течение 6 дней (группа «СТГ»); животных третьей группы иммунизировали КВС одновременно с инъекцией СТГ, как указано выше (группа «КВС+СТГ»). Животные четвертой группы получали 0,9% NaCl в объеме 0.1 мл/кг веса дважды в день в течение 6 дней («Контроль»). От животных до начала инъекций и через две недели после их окончания получали образцы сыворотки крови.

В сыворотке крови с помощью полуавтоматического биохимического анализатора Sinnowa BS-3000P с использованием соответствующих наборов реагентов ЗАО «Диакон-ДС» согласно указаниям производителя определяли концентрацию общего белка, глобулина, глюкозы, активность ферментов АЛТ, АСТ, КК и ЛДГ; вычисляли интегральные показатели биохимического статуса - коэффициент де Ритиса и индекс ферментемии (ИФ) [17].

Определение агглютинативной активности сыворотки крови против клеток суточной агаровой культуры E. coli Б-5 проводили в объемной модификации в разведении сыворотки крови 1:50 в физиологическом растворе, полноту агглютинации оценивали в крестах [24].

Определяли способность сыворотки крови поддерживать рост E. coli Б-5 in vitro. Образцы сыворотки крови инокулировали клетками E. coli Б-5 до плотности 10 млн КОЕ/мл, полученные культуры инкубировали 6 ч при 37 ºС. Концентрацию колониеобразующих единиц E. coli Б-5 в культурах определяли высевом на мясопептонный агар. Находили связь роста плотности культуры с биохимическими параметрами крови, используя методы корреляционного анализа – корреляцию Пирсона и множественной корреляции, достоверность различий определяли в тесте Стьюдента [25].

Через 3 недели после начала инъекций все экспериментальные животные были заражены внутривенно летальной дозой E. coli Б-5 (2*109 КОЕ/кг веса). В течение 2 недель после заражения регистрировали гибель животных, по истечении 14 дней выживших животных забивали и производили патоморфологический анализ органов [26].

Результаты исследования и обсуждение. Иммунизация культурой E. coli Б-5 с восстановленным селеном усиливает агглютинирующую способность сыворотки крови в отношении клеток бактерии. Степень агглютинации клеток E. coli Б-5 составила для групп «КВС» и «КВС+СТГ» - «++++», для животных группы «СТГ» - «++», для «Контроля» – «+».

Как иммунизация, так и применение СТГ заметно сказываются на биохимических показателях, причем разным образом (табл. 1).

Таблица 1

Активность ферментов сыворотки крови и значения коэффициента де Ритиса и индекса ферментемии у подопытных животных на 14-й день эксперимента, нКат/л

Группы, n=6

АЛТ

АСТ

КФК

ЛДГ

Коэффициент де Ритиса

Индекс ферментемии

СТГ

293 ± 271

717 ±481

5248 ±3481

3687 ±5521

2,44 ±0,18

4,06 ±0,36

КВС

295 ±281

1052 ±1071

9350 ±938

4772 ±715

3,56 ±0,381

5,74 ±0,441

КВС + СТГ

413 ±331

682 ±631

8595 ±1023

5165 ±773

1,65 ±0,191

3,45 ±0,811

Контроль

353 ±45

865 ±85

8972 ±1002

4968 ±745

2,45 ±0,19

4,43 ±0,16

Примечание: 1 – значение отличается от контроля при p<0,05.

Иммунизация у животных группы «КВС» приводит к росту активности АСТ при снижении активности АЛТ, вызывая повышение коэффициента де Ритиса и индекса ферментемии (ИФ), что свидетельствует о биохимическом сопровождении иммунизации. Инъекции СТГ приводят к падению активности всех ферментов и некоторому, недостоверному, снижению ИФ, что свидетельствует о преобладании анаболических процессов. Введение СТГ при иммунизации приводит к росту активности АЛТ при падении АСТ, мало затрагивая активность остальных ферментов, что приводит к падению значений коэффициента де Ритиса и ИФ в сравнении с контролем. Таким образом, СТГ при иммунизации стимулирует изменение активности комплекса ферментов, стимулирующее анаболические процессы [16].

Данные по влиянию инъекций СТГ и КВС на концентрацию глюкозы, общего белка и глобулинов в сыворотке крови приведены в таблице 2. СТГ вызывал рост концентрации общего белка и глобулина, что свидетельствует о стимуляции анаболизма. Иммунизация КВС приводила к падению концентрации глобулина в сыворотке, но параллельное введение СТГ, снижая концентрацию общего белка, повышало концентрацию глобулина.

Таблица 2

Концентрации общего белка, глобулина и глюкозы в сыворотке крови экспериментальных животных на 14-й день эксперимента

Группы

Глюкоза, мМ/л

Общий белок, г/л

Глобулин, г/л

СТГ

6,97 ±1,04

56,70 ±6,981

15,38 ±2,301

КВС

6,31 ±0,94

53,79 ±6,51

9,51 ±1,421

КВС + СТГ

6,01 ±0,90

43,01 ±3,451

18,01 ±2,701

Контроль

6,15 ±0,92

48,40 ±3,26

13,76 ±2,06

Примечание: 1 – значение отличается от контроля при p<0,05.

 

Плотность колониеобразующих единиц в культурах E. coli Б-5 на сыворотке крови in vitro на 6-й час инкубации составила для группы «КВС» 327±5, для «КВС + СТГ» 27±1, для группы «СТГ» составила 248±4 и для контроля – 177±3 миллионов КОЕ/мл. Неожиданным фактом является более сильный рост E. coli Б-5 в сыворотке крови животных, иммунизированных только культурой с восстановленным селеном, сыворотка животных, получавших СТГ, также хорошо поддерживала рост бактерии. Однако сыворотка крови животных, параллельно получавших КВС и СТГ, поддерживала рост хуже, чем сыворотка контрольных животных, т.е. вакцинация КВС совместно с инъекциями СТГ снижает пригодность сыворотки крови для роста E. coli Б-5.

Корреляционный анализ плотности колониеобразующих единиц E. coli Б-5 в культурах на сыворотке крови для всех животных, независимо от иммунизации или инъекций СТГ, выявил сильную связь роста с активностью АЛТ (табл. 1) и слабую - с концентрацией глюкозы в сыворотках (табл. 2). Корреляционный коэффициент Пирсона для пары КОЕ/АЛТ составил -0,97 (p<0.05), для пары КОЕ/глюкоза +0,54 (p>0.05), коэффицент множественной корреляции для плотности КОЕ с АЛТ и концентрацией глюкозы составил 1,00 (p<0.01). Таким образом, рост бактерии в сыворотке контролируется как глюкозой, так и активностью АЛТ. Ранее для Staphylococcus aureus было показано отрицательное влияние активности АЛТ на рост бактерии в сыворотке крови, что связано с отрицательным влиянием продукта активности фермента – пирувата – на скорость размножения клеток [27]. S. aureus обладает смешанным аэробно-анаэробным метаболизмом, подобным метаболизмом обладает и E. coli Б-5, что может объяснить отрицательное влияние активности АЛТ на рост последней, и рост E. coli Б-5 в сыворотке экспериментальных животных контролируется не только концентрацией специфических иммуноглобулинов, но и ферментемией сыворотки.

СТГ активизирует анаболизм, что сказалось на приросте массы тела животных группы «СТГ» на 0,08 ± 0,01 кг за 14 дней эксперимента. Вес кроликов, иммунизированных КВС, уменьшился, снижение веса составило 0,25 ± 0,03 кг. У животных остальных групп также наблюдались отрицательные приросты массы тела, для «КВС + СТГ» составившие 0,10 ±0,02 и для «Контроля» – 0,05 ±0,01 кг. Снижение веса в группе «КВС + СТГ» было меньше, чем в группе «КВС», что свидетельствует об анаболическом действии СТГ при иммунизации.

Выживаемость при заражении летальной дозой клеток E. coli Б-5 составила 50% для животных, иммунизированных КВС; 0% для животных, получавших СТГ, и 100% при одновременном введении КВС и СТГ, что свидетельствует об иммуностимулирующем эффекте соматотропного гормона.

По истечении 20 дней после заражения произвели патоморфологическое обследование выживших животных. У кроликов группы «КВС» наблюдались круппозная пневмония, регионарный лимфонодулит и признаки гипертермии, у животных группы «Sе бульон+СТГ» обнаружена только гиперемия легких. Таким образом, СТГ может ослаблять остаточные явления и ускорять клиническое выздоровление при колибактериозе.

Заключение

Протективность иммунизации кроликов культурой E. coli Б-5 с восстановленным селеном при летальном заражении составляет 50%. Использование соматотропного гормона повышает протективность иммунизации до 100% и уменьшает остаточные явления у выживших животных, нормализирует метаболизм и вес при иммунизации, корректируя ряд биохимических показателей. Таким образом, применение СТГ и восстановленного селена в качестве адъюванта может быть перспективным при борьбе с колибактериозом.