Сифилис – одно из самых распространенных венерических заболеваний на планете. По данным Всемирной Организации Здравоохранения ежегодно в мире регистрируется не менее 12–15 миллионов новых случаев сифилитической инфекции [1]. В последние десятилетия отмечается структурное перераспределение клинических форм заболевания с распространением эпидемиологически неблагоприятных ранних скрытых форм сифилиса, а также поздних скрытых форм с развитием висцерального и нейросифилиса [2, 3]. Несмотря на успехи современной венерологии, у 2–20 % больных после лечения наблюдается развитие серорезистентности [2, 3, 4].
За последние три десятилетия появились доказательства определяющей роли врожденного и адаптивного иммунитета в развитии сифилиса [5-9]. Показано, что характерной чертой персистирующего течения заболевания является формирование динамического равновесия между бледной трепонемой и иммунной системой «хозяина», изменения в котором могут привести к диссеминации T. Pallidum с формированием вторичных форм и серорезистентности [8, 9].
Цель исследования: анализ показателей иммунофенотипирования клеток крови и сывороточных иммуноглобулинов у пациентов с серорезистентным, ранним и поздним скрытым сифилисом.
Материал и методы исследования. В работе представлены данные, полученные при иммунологическом обследовании 100 больных сифилитической инфекцией, находившихся под наблюдением в Краевом клиническом кожно-венерологическом диспансере. В группу I вошли 35 пациентов с ранним скрытым сифилисом, в группу II – 24 пациента с поздним скрытым сифилисом, в группу III – 41 пациент с серорезистентным сифилисом. Контрольную группу составили 50 здоровых респондентов, сопоставимых по возрасту и полу.
Для обеспечения репрезентативности полученных результатов из исследования были исключены ВИЧ-инфицированные пациенты, больные сахарным диабетом, аутоиммунными, аллергическими и онкологическими заболеваниями.
Иммунофенотипирование лимфоцитов осуществляли методом проточной цитометрии с использованием одно- и двухпараметрических реагентов линии IQTest: CD19-PC5, HLA-DR-PC5, CD3-FITC/CD4-PЕ, CD8-PC5, CD3-FITC/CD (16+56)-PЕ, CD45-ECD фирмы Beckman Coulter, США на лазерном проточном цитометре Cytomicx FC 500 фирмы Beckman Coulter, США.
Общее количество лейкоцитов, относительное и абсолютное содержание субпопуляций лимфоцитов определяли с использованием одноплатформенной технологии с помощью гетерогенного гейтирования по панлейкоцитарному маркеру CD45+ и показателям светорассеяния с применением калибровочных частиц Flow-Count Fluorоspheres фирмы Beckman Coulter, США.
Определение иммуноглобулинов A, G, M в сыворотке крови выполняли методом количественной иммунотурбодиметрии с помощью биохимического анализатора AU 680 500 фирмы Beckman Coulter, США. Для анализа использовали реактивы фирмы Beckman Coulter, США. Оценку внутриклеточного кислородзависимого метаболизма нейтрофилов крови проводили с помощью НСТ-теста в модификации А.Н. Маянского и М.Е. Виксмана (1979). Фагоцитарную активность нейтрофилов и моноцитов крови исследовали на модели поглощения частиц латекса (Фрейдлин И.С., 1986).
Для статистического анализа данных использовали пакет программ «Primer of Biostat 4,0», Attestat 10.5.1.». Количественные значения с распределением, отличным от нормального, представляли в виде медианы и интерквантильного (25 и 75 процентили) размаха (Me (Q1-Q)).
Для оценки межгрупповых различий применяли однофакторный дисперсионный анализ, критерии Ньюмена – Кейлса, Данна. Достоверными считали различия при p<0,05.
Результаты исследования и их обсуждение. Показатели фагоцитоза и оксидазной активности нейтрофильных гранулоцитов у пациентов с сифилисом не отличались от здоровых респондентов (таблица).
Показатели иммунного статуса у пациентов с сифилисом
|
Показатель |
Ранний скрытый сифилис (I) (n=35) |
Поздний скрытый сифилис (II) (n=24) |
Серо- резистентный сифилис (III) (n=41) |
Контрольная группа (IV) (n=50) |
P |
|
Лейкоциты |
7,7 (7,0-8,4) |
7,6 (6,7-8,5) |
6,9 (6,4-7,5) |
7,0 (6,6-7,3) |
|
|
Лимфоциты |
26,8 (25,1-28,4)* |
27,7 (25,9-29,5)* |
28,4 (26,4-30,4)* |
31,1 (29,2-32,9) |
|
|
Фагоцитоз, % |
69,7 (64,9-74,6) |
70,8 (64,7-77,3) |
69,8 (66,1-73,5) |
73,1 (1,2-74,9) |
|
|
НСТ сп., % |
5,1 (3,4-6,8) |
5,8 (3,5-8,1) |
6,4 (5,1-7,7) |
5,4 (4,8-6,0) |
|
|
ИС НСТ |
3,5 (2,6-4,5) |
3,4 (2,4-4,0) |
2,4 (2,1-2,7) |
2,9 (2,8-3,0) |
|
|
CD3+, % |
73,1 (70,3-75,8) |
69,2 (65,6-72,7) |
71,5 (68,1-74,9) |
72,3 (70,7-73,8) |
|
|
CD3+, *109/л |
1,58 (1,40-1,76) |
1,66 (1,45-1,86) |
1,35 (1,20-1,49)* |
1,62 (1,50-1,73) |
|
|
CD4+,% |
45,1 (43,7-46,5) |
44,6 (42,0-47,2) |
43,6 (44,1-46,1) |
45,8 (44,2-47,4) |
|
|
CD4+, *109/л |
1,10 (0,81-1,32) |
1,15 (0,86-1,44) |
0,81 (0,72-0,90)* |
1,03 (0.96-1,11) |
pI-III<0,05 pII-III<0,05 |
|
CD8+,% |
27,0 (23,8-30,3)* |
27,9 (23,8-31,9)* |
26,7 (23,8-29,5)* |
22,7 (21,3-24,2) |
|
|
CD8+, *109/л |
0,56 (0,45-0,66) |
0,62 (0,50-0,74) |
0,52 (0,45-0,59) |
0,50 (0,44-0,57) |
|
|
HLADR+, % |
21,2 (18,5-23,9)* |
19,2 (16,2-22,3)* |
18,9 (15,7-22,1)* |
3,81 (3,57-4,06) |
|
|
HLADR+,*109/л |
0,41 (0,36-0,47)* |
0,40 (0,32-0,48)* |
0,42 (0,33-0,51)* |
0,11 (0,07-0,15) |
|
|
CD16+, % |
13,8 (11,7-16,0) |
14,1 (11,2-16,9) |
11,5 (9,3-13,6)* |
14,1 (12,7-15,5) |
|
|
CD16+,*109/л |
0,30 (0,22-0,37) |
0,26 (0,20-0,32) |
0,25 (0,19-0,31) |
0,31 (0,28-0,35) |
|
|
CD19+, % |
13,5 (11,0-15,9) |
14,9 (11,7-18,1) |
12,1 (10,4-13,7) |
12,0 (11,2-12,8) |
|
|
CD19+, *109/л |
0,27 (0,21-0,33) |
0,29 (0,22-0,35) |
0,23 (0,19-0,27) |
0,26 (0,24-0,28) |
|
|
IgМ, г/л |
1,53 (1,25-1,82) |
1,82 (1,53-2,10)* |
1,24 (1,07-1,41) |
1,35 (1,21-1,49) |
|
|
IgG, г/л |
11,7 (11,2-12,2) |
12,3 (11,7-13,0) |
11,8 (10,8-12,9) |
11,9 (11,3-12,4) |
|
|
IgA, г/л |
2,87 (2,54-3,20)* |
2,7 (2,3-3,2)* |
2,57 (2,31-2,84)* |
1,35 (1,21-1,49) |
|
Примечание:*-p<0,05 – по сравнению с контрольной группой, pI-II,pI-III,pII-III – достоверность межгрупповых различий (критерий Ньюмена – Кейлса, критерий Данна), n – число пациентов.
У больных всех клинических групп отмечалось снижение относительного содержания лимфоцитов, что согласуется с данными, представленными в литературе.
Содержание Т-лимфоцитов и Т-хелперов при раннем и позднем скрытом сифилисе не отличалось от аналогичных показателей у здоровых доноров (таблица).
У пациентов всех групп установлено увеличение средних показателей HLADR+ Т-лимфоцитов (таблица, рис.1a, 1б).
а)HLADR+,% б)HLADR+, abs
Рис. 1. Содержание HLADR+-лимфоцитов у пациентов с сифилисом
Примечание: p – достоверные отличия по сравнению с контрольной группой; К – контрольная группа, I – ранний скрытый сифилис II – поздний скрытый сифилис, III – серорезистентный сифилис (критерий Ньюмена – Кейлса, критерий Данна).
В группе с серорезистентным сифилисом определялось снижение абсолютного содержания CD3+- и CD4+-клеток по сравнению со здоровыми людьми. Установлены достоверные различия абсолютных показателей CD4+-лимфоцитов при серорезистентном сифилисе по сравнению с ранним и поздним скрытым сифилисом (таблица, рис. 2б).
а) CD4+, % б) CD4+, abs
Рис. 2. Содержание CD4+-лимфоцитов у пациентов с сифилисом
Примечание: p – достоверные отличия по сравнению с контрольной группой; К – контрольная группа, I – ранний скрытый сифилис II – поздний скрытый сифилис, III – серорезистентный сифилис (критерий Ньюмена-Кейлса, критерий Данна).
Примечание: p – достоверные отличия по сравнению с контрольной группой; К – контрольная группа, I – ранний скрытый сифилис II – поздний скрытый сифилис, III – серорезистентный сифилис (критерий Ньюмена-Кейлса, критерий Данна).
Развитие серорезистентности при сифилисе нередко связано с изменением баланса CD4+/CD8+-лимфоцитов [6]. Низкие показатели CD3+- и CD4+-лимфоцитов у пациентов с серорезистентностью подтверждаются ранее проведенными исследованиями [7, 10]. Содержание и функциональная активность Т-хелперов (CD4+) имеет ключевое значение в развитии реакций гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) и может рассматриваться в качестве одного из факторов, способствующих формированию серорезистентности [6]. Известно, что отсутствие негативации комплекса серологических реакций с высокой частотой отмечается у ВИЧ-инфицированных и иммунокомпрометированных больных сифилисом, что сопровождается ухудшением течения заболевания и отрицательно влияет на результаты лечения [8]. Вероятно, снижение количества CD4+-лимфоцитов у пациентов с серорезистентным сифилисом может быть связано с недостаточным синтезом IL2 и IL12 мононуклеарами периферической крови [6].
Существует мнение, что дефицит Th1 при вторичном сифилисе обусловлен высоким уровнем апоптоза периферических лимфоцитов посредством активации Fas-опосредованного пути, что затрудняет санацию организма и создает предпосылки для хронизации инфекции [7]. Кроме того, установлено снижение функциональных показателей Th1 по сравнению со здоровыми респондентами [6].
При оценке субпопуляций Т-лимфоцитов нами выявлено увеличение относительного содержания CD8+-лимфоцитов у пациентов всех групп (таблица, рис.3а).
а) CD8+, % б) CD8+, abs
Рис. 3. Содержание CD8+-лимфоцитов у пациентов с сифилисом
Примечание: p – достоверные отличия по сравнению с контрольной группой (критерий Ньюмена – Кейлса, критерий Данна); К – контрольная группа, I – ранний скрытый сифилис, II – поздний скрытый сифилис, III – серорезистентный сифилис.
Примечание: p – достоверные отличия по сравнению с контрольной группой (критерий Ньюмена – Кейлса, критерий Данна); К – контрольная группа, I – ранний скрытый сифилис, II – поздний скрытый сифилис, III – серорезистентный сифилис.
Роль Т-цитотоксических/эффекторов в клиренсе бледных трепонем до конца не определена. По мнению ряда авторов их увеличение может отражать динамику иммунного ответа, направленного на элиминацию внутриклеточного патогена и имеет компенсаторный характер [6, 11, 12].
В случае экспериментальной инфекции ранее было показано, что появление CD8+ - клеток в месте внедрения T. Pallidum регистрируется уже на 11–18 день после заражения, при этом их преобладание над CD4+-клетками отмечается в период разрешения процесса между 25 и 39 днем [13]. Установлено, что сифилитические инфильтраты при твердом шанкре у пациентов с сифилисом содержат преимущественно Т-хелперы, в то время как Т-цитотоксические/эффекторы преобладают при вторичных сифилитических поражениях [13]. Вероятно, активированные CD8+-лимфоциты могут вносить свой вклад в увеличение IFɤ, необходимого для активации макрофагов и реализации ГЗТ или лизировать эпителиальные клетки, инфицированные T. Pallidum, что подтверждается присутствием матричной РНК перфорина и гранзима [9].
Вместе с тем существует мнение, что активация CD8+-лимфоцитов при сифилисе подавляет реакцию ГЗТ и синтез опсонизирующих антител [9], имеющих определяющее значение в клиренсе T. Pallidum.
При иммунофенотипировании клеток крови у пациентов с серорезистентным сифилисом нами выявлено статистически достоверное уменьшение количества NK-клеток (таблица).
Известно, что NK-клетки играют основную роль в иммунном ответе на внутриклеточные патогены, способствуя синтезу IFNɤ, поляризации Т-лимфоцитов и созреванию дендритных клеток. Натуральные киллеры являются основным источником IFNɤ при стимуляции мононуклеаров периферической крови липопротеинами T. Pallidum [11], что согласуется с существующими в литературе сведениями об уменьшении активности NK-клеток при развитии сифилиса [9, 12].
В исследованиях последних лет у пациентов с вторичной сифилитической инфекцией выявлено появление нетипичной популяции циркулирующих NK (CD56-CD16+) с низким потенциалом секреции IFɤ и других интерлейкинов [9].
При оценке сывороточных иммуноглобулинов нами зарегистрировано увеличение уровня IgM у пациентов с поздним скрытым сифилисом и повышение значений IgA у больных всех групп без достоверных межгрупповых различий. Высокие концентрация сывороточных иммуноглобулинов при сифилисе получены в ряде исследований ранее и, вероятно, обусловлены продолжительной антигенной симуляцией в условиях активной персистенции T. Pallidum [9, 14].
Таким образом, при иммунофенотипировании клеток крови у пациентов с серорезистентным, ранним и поздним скрытым сифилисом отмечается перераспределение состава иммунокомпетентных клеток с увеличением количества Т-цитотоксических/эффекторов. Увеличение количества активированных лимфоцитов свидетельствует об активации иммунного ответа в условиях персистенции T. Pallidum.
Признаки дефицита Т-клеточного звена иммунитета определяются преимущественно у пациентов с серорезистентным сифилисом в виде уменьшения количества Т-хелперов, NK-клеток. Полученные данные целесообразно использовать при интерпретации результатов серологических исследований у пациентов с сифилисом и для прогнозирования различных форм заболевания.