Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,120

USE OF PHASE MICROSCOPY POSSIBILITIES FOR STUDYING THE CULTURE OF ADHESIVE CELLS

Nefedova I.F. 1 Rossinskaya V.V. 1 Volova L.T. 1 Boltovskaya V.V. 1 Kulagina L.N. 1
1 FGBOU VO "Samara State Medical University" of the Ministry of Health of Russia, IEMB
In this paper, using the example of human dermal fibroblasts, a method for adapting the capabilities of the MIM-340 interference microscope to study cultures of adhesive cells is presented. With this purpose, the authors developed a method for sterilizing dielectric glass with a mirror coating. The principal possibility of growing a culture of human dermal fibroblasts on dielectric slide glasses is shown. Fibroblasts show somewhat less affinity for dielectric glasses than for conventional ones, while the cell structure and the nature of their growth remain unchanged, but the proliferative activity remains somewhat lower throughout the entire experiment than in the control. Comparative characteristics of various methods of microscopic examination of biological objects are given and the advantages of interference microscopy are shown when studying their surface. Phase portraits of nuclei were obtained in the native culture of fibroblasts and their phase thickness was determined.
cell culture
fibroblasts
modulation interference microscopy
phase portrait

В настоящее время приобрело широкое распространение тестирование различных препаратов, изделий медицинского назначения и физических факторов на культурах адгезивных клеток [1]. Разработано и используется множество протоколов для проведения данных доклинических исследований. Оценка результатов осуществляется различными лабораторными методами, среди которых одним из основных является морфологический.

В последние годы наблюдается устойчивый рост интереса к сверхразрешающим методам оптической микроскопии. Однако широко применяемые в медико-биологических исследованиях методы электронной, атомно-силовой, конфокальной и когерентной микроскопии ограничены вследствие низкого (150…200нм) латерального разрешения [2, 3], высокой погрешности измерений, многочисленных артефактов и трудоемкой пробоподготовкой.

Относительно недавно был предложен метод модуляционной интерференционной микроскопии, на основе которого разработано новое поколение быстродействующих оптических профилометров с разрешением в плоскости XY 10–100 нм. Метод интерференционной микроскопии позволяет не только получить изображение структуры с нанометровым разрешением, но и провести комплексный анализ оптических свойств объекта [4]. Одним из таких профилометров является модуляционный интерференционный микроскоп (МИМ).

Сравнительные характеристики возможностей различных микроскопов представлены нами в таблице 1.

Таблица 1

Сравнительная характеристика различных методов микроскопического исследования поверхности биологических объектов

Метод

Увеличе-ние

Рабочая среда

Изобра-жение

Воздействие на образец

Пробоподготовка

Световая микроскопия

103

воздух

жидкость

2D

инвазивное

неинвазивное

фиксация

окраска

Сканирующая электронная микроскопия

106

вакуум

2D

инвазивное

фиксация

сушка

Сканирующая зондовая микроскопия

109

вакуум

воздух жидкость

3D

инвазивное

сушка

фиксация

Флуоресцентная микроскопия

109

воздух жидкость

3D

инвазивное

фиксация

окраска

Конфокальная микроскопия

109

воздух

3D

инвазивное

фиксация

окраска

Интерференцион- ная микроскопия

109

воздух

3D

неинвазивное

---

 

В литературе описаны результаты исследования методом интерференционной микроскопии клеток крови [5,6], бактерий [7], спор микроорганизмов [8], опухолевых клеток [9], нейрон-глиальной сети [10]. Данных по изучению культур адгезивных клеток в доступной литературе нами обнаружено не было.

Разработанный ОАО «ПО «УОМЗ» (Россия) микроскоп МИМ-340 был передан Институту экспериментальной медицины и биотехнологий СамГМУ в рамках договора о временном безвозмездном пользовании в целях проведения фундаментальных медико-биологических исследований (Договор № А0104 от 04.05.2015 г.).

На базе ИЭМБ СамГМУ располагаются лаборатории, где выращивают культуры клеток из различных источников для использования в доклинических исследованиях, в том числе в качестве тест-систем. Такие культуры должны отвечать требованиям, которые задаются соответственно целям и задачам каждого эксперимента. Для этого все культуры проходят процедуру идентификации с использованием комплекса методов исследования. В связи с этим расширение комплекса методов идентификации является актуальным.

Цель нашей работы – адаптировать возможности интерференционного микроскопа МИМ-340 для исследования культур адгезивных клеток.

Согласно руководству по эксплуатации данного микроскопа, изучаемый объект следует помещать под объектив на диэлектрическом предметном стекле с зеркальным покрытием. Препараты из перечисленных выше биообъектов авторы изготавливали непосредственно перед микроскопированием. Если готовить подобным образом препарат из адгезивной культуры, необходимо «снять» клетки с поверхности культурального пластика, где они инкубировались в ростовой среде. Данная манипуляция сильно искажает морфологические характеристики клеток.

Для того чтобы получить возможность изучать нативную культуру с помощью МИМ-340, было принято решение вырастить клетки непосредственно на стекле с зеркальным напылением. Поскольку клетки invitro культивируются только в стерильных условиях, а стекла поставляются нестерильными, необходимо было разработать метод их стерилизации. Данный способ был разработан авторами в 2016 году, подана заявка на патент («Уведомление о поступлении заявки на изобретение» № 20161130601 от 25.07.2016).

Материалы и методы

Было проведено изучение использования возможностей МИМ-340 применительно к культуре адгезивных клеток.

Исследования осуществляли на культурах дермальных фибробластов человека 7 пассажа, которые выращивали в лаборатории культуры клеток ИЭМБ СамГМУ. Первичный материал получали у доноров с соблюдением всех требований биоэтики после подписания информированного согласия. Фибробласты (4,5х104 клеток в 100 мкл полной ростовой среды) высевали на стерильные диэлектрические стекла с зеркальным покрытием (опытная группа) и на стерильные предметные стекла (контрольная группа). Стекла выдерживали во влажной камере в течение 60 минут для обеспечения прикрепления клеток к поверхности, затем помещали в стерильные чашки Петри и заливали ростовой средой. Культивирование проводили в полной ростовой среде следующего состава: среда 199 – 90 %, эмбриональная телячья сыворотка – 10 % (среда и сыворотка – ООО «БиолоТ», РФ), гентамицин – 40 мкг/мл- в условиях СО2-инкубатора (Sanyo – Incubator, MCO -18AС, Япония) при температуре 37 °С, 5 % СО2 и постоянной влажности в течение 7 суток. В эксперименте было задействовано 48 объектов (по 24 стекла в каждой группе).

Дермальные фибробласты контрольной серии изучали и фотографировали с помощью инвертированного микроскопа Olympus СКX 41 с цифровой камерой SC100 и программным обеспечением Cell Sence Entry при увеличении 200, 400.

Препараты опытной серии изучали с помощью интерференционного микроскопа МИМ-340. После извлечения стекла с зеркальным покрытием с культурой из ростовой среды по периметру стекла прокладывали спейсер высотой 10–15мкм. На ограниченную спейсером поверхность наносили 20 мкл ростовой среды и накрывали покровным стеклом. Полученный таким образом препарат помещали под объектив микроскопа. Монослой оценивали в навигационном канале. Так как площадь измерения оптической плотности ограничена пределами стандартной рамки (отображающей площадь интерференционного канала), мы избрали ядро фибробласта в качестве объекта для детального исследования.

Для определения жизнеспособности клеток использовали общепринятую методику окраски витальным красителем трипановым синим. Количество живых и мертвых клеток подсчитывали в 5 полях зрения каждого стекла при увеличении 100, результат выражали в процентах.

Сравнительный анализ морфофункционального состояния опытных и контрольных культур в динамике проводили, основываясь на следующих показателях: плотность монослоя, индекс адгезии IA, время удвоения TD, количество удвоений KD. Для этого сначала через 24 часа, а затем каждые 48 часов эксперимента клетки снимали со стекол стандартным способом (по 6 стекол из каждой группы) и считали при помощи ручного автоматического счетчика клеток Scepter (Millipore, США).

Индекс адгезии (IA) рассчитывали по формуле:

гдеN1 – посевная доза, Nt – количество клеток на стекле через 24 часа после посева, и выражали в процентах (%).

Время удвоения культуры (TD) рассчитывали по формуле:

,

где t – время роста культуры (часы), N0 – начальное количество клеток, Nt – количество клеток через t часов.

Количество удвоений культуры (KD) вычисляли по формуле:

где N0 – количество клеток в монослое через 24 часа после посадки, Nt – количество клеток в монослое по окончании эксперимента.

Статобработка. Статистическая обработка результатов исследования была проведена с помощью операционной системы Windows-7, программного комплекса Microsoft Office Excel 2010. Нормальность распределения количественных признаков определяли с помощью критерия Шапиро – Уилка. Результаты были представлены в виде среднего арифметического (M) и стандартной ошибки выборочной средней (m) [11,12]. Для определения равнозначности сравниваемых групп использовали t-критерий Стьюдента. Значимыми считались отличия при p ≤ 0,05 (95 %).

Результаты и их обсуждение. Проведенное исследование показало, что и в опытной, и в контрольной серии в течение всего эксперимента фибробласты сохраняли свойственную им форму, размеры, количество ядер и отростков, структуру цитоплазмы, характер роста в монослое. При микроскопировании препарата как с помощью МИМ-340 (камера навигационного канала), так и инвертированного микроскопа мы наблюдали расправленные клетки веретенообразной формы с 2–4 отростками (рис.1 а,б), контактирующими между собой. Цитоплазма фибробластов гомогенная, ядра с 1–2 ядрышками четко визуализировались. При окраске трипановым синим в монослое выявлялись преимущественно жизнеспособные клетки (табл. 2).

Вместе с тем дермальные фибробласты человека с самого начала эксперимента проявили несколько меньшее сродство к диэлектрическим стеклам: индекс адгезии опытной культуры составил 85 %, по сравнению с 96 % в контроле. Время удвоения опытной культуры, отражающее ее пролиферативную активность, было стабильным на всем протяжении эксперимента, сохраняясь достоверно ниже контрольного показателя (таб. 2), что, по-видимому, связано с более слабым сцеплением клеток с зеркальной поверхностью. В результате формирование монослоя в опытной серии происходило равномерно и диффузно, с сохранением характера роста, свойственного нормальной культуре дермальных фибробластов человека, но плотность монослоя в течение всего эксперимента значимо меньше, чем в контроле. За 7 суток в опытной группе произошло 4,0691 удвоение, в контрольной группе – 4,7558 удвоений.

а   б

Рис.1. Культура дермальных фибробластов человека, 5 суток. Окраска трипановым синим. а)МИМ, камера навигационного канала; б) световой микроскоп. Ув. 400

Таблица 2

Сравнительная характеристика культур фибробластов при посеве на обычные и диэлектрические предметные стекла

Показатели

1сутки эксперимента

3 суток

эксперимента

5 суток

эксперимента

7 суток

эксперимента

Конт

роль

Опыт

Конт

роль

Опыт

Конт

роль

Опыт

Конт

роль

Опыт

Плотность монослоя, кл/1 мм2

43,20±1,23

38,25±

1,51*

139,97±4,53

97,92± 3,97*

404,51±12,21

250,68±

17,92*

1169,03±25,49

641,74±

18,98*

Время удвоения, ч

-

-

28,30±0, 83

35,40±1,62*

31,35 ±0, 61

35,39±1,17*

31,35 ±0,89

35,39±1,24*

Живые

клетки в монослое, %

96,41±

0,56

94,62±

1,02

97,61±

2,14

95,53±

1,57

96,51±

1,73

95,63±

0, 94

96,42±

1,66

94,61±

1,42

Примечание: * – р< 0.05 по сравнению с контролем.

Фазовые изображения, полученные с помощью МИМ-340, представляют собой оптическую разность хода интерферирующих лучей. Физиологические процессы, происходящие в клетке, а также фазы клеточного цикла приводят к изменениям оптических параметров (изменение оптической плотности). Используя разработанный нами способ выращивания клеток на диэлектрических стеклах, мы получили возможность определять фазовую высоту ядер нативных фибробластов в культуре (рис. 2,3). Фазовый портрет представляет собой временную последовательность профилей фазовой толщины по скан- линии при периодически многократном сканировании объекта. Команда «Сечение» позволяет задавать начальную и конечную точку произвольного сечения и выводить его график в отдельном окне. При средних размерах ядер живых дермальных фибробластов (длина – 27,14 ±2,4 мкм, ширина – 16,7±3,2 мкм) средняя фазовая высота их к концу эксперимента составила 142,17±21,7 нм. Следует обратить внимание на несовпадение терминов «геометрическая толщина» и «фазовая толщина» объекта [8].

Рис.2. Фазовый портрет ядра фибробласта Рис.3. Профиль фазовой толщины ядра фибробласта

Выводы

В ходе наших исследований была продемонстрирована возможность выращивания культуры дермальных фибробластов человека на диэлектрических стеклах без изменения структуры клеток и характера их роста. В результате была доказана возможность исследования нативных клеток в монослое с использованием интерференционного канала МИМ-340 максимально длительное время. Были получены фазовые портреты ядер в нативной культуре фибробластов и определена их фазовая толщина.