Одним из приоритетных направлений работы экспериментальной лаборатории ФГБУ «ПФМИЦ» Минздрава России является создание моделей заболеваний опорно-двигательного аппарата, усовершенствование имеющихся, разработка и внедрение в практику новых материалов и способов лечения патологии костей и суставов.
Большой интерес к экспериментальным моделям аваскулярного некроза головки бедренной кости (АНГБК) объясняется широкой распространенностью и высокой социальной значимостью данного заболевания [1-3]. Поскольку для применения новых способов лечения остеонекроза в клинической практике их эффективность должна быть доказана экспериментально на доклинических этапах исследования, разработка адекватной модели АНГБК является важной задачей.
В настоящее время в литературных источниках описывается большое количество методик, моделирующих АНГБК у различных лабораторных животных (крысы, кролики, собаки и т.д.). В подавляющем большинстве работ моделирование остеонекроза выполняется путем удаления надкостницы, перевязки мышц проксимального отдела бедра, иссечения или перевязывания круглой связки, кругового иссечения капсулы тазобедренного сустава, применения лигатуры вокруг шейки бедренной кости, блокады артериального кровоснабжения путем введения талька, водной взвеси серебра и других веществ [4-6]. Широко используется моделирование стероидиндуцированного некроза головки бедренной кости у кроликов путем внутривенного введения липополисахарида 10 мкг/кг массы тела дважды, с интервалом 24 часа, и внутримышечной инъекцией метилпреднизолона 20 мг/кг массы тела три раза с интервалом 24 часа [7-9]. Существует методика создания некроза головки бедренной кости с использованием жидкого азота, с экспозицией в области головки в течение 3-х минут и дальнейшим отмыванием головки бедренной кости теплым физиологическим раствором [10]. Известен также способ моделирования АНГБК путем параартикулярного введения 0,1 % раствора адреналина в течение 20–30 дней через каждые 6 часов в количестве 0,1–0,3 мл [11].
Большинство существующих хирургических методик моделирования аваскулярного некроза головки бедренной кости достаточно травматичны, а при лекарственно-индуцированном АНГБК не исключен системный эффект препаратов на организм лабораторных животных.
Одной из основных задач при разработке экспериментальной модели аваскулярного некроза головки бедренной кости, учитывая необходимость повторного оперативного вмешательства на тазобедренном суставе для исследования различных свойств и эффективности применения новых материалов для пластики дефекта, являлось снижение травматичности и максимальное сходство с хирургическим доступом, используемым для лечения АНГБК в клинической практике [12].
Цель исследования – предложить экспериментальную модель аваскулярного некроза головки бедренной кости.
Материалы и методы исследования
Для моделирования аваскулярного некроза головки бедренной кости в качестве объекта исследования были отобраны 17 кроликов в возрасте 6±1 месяцев с массой тела 3500±500 грамм. Кролики были выбраны для проведения данного вида исследований благодаря своей доступности и анатомическим особенностям – размеры головок бедренных костей этих лабораторных животных являются оптимальными [13]. Эксперимент был одобрен решением локального этического комитета при ФГБУ «ПФМИЦ» Минздрава России (выписка из протокола № 6 от 20 мая 2016) и проводился в соответствии с методическими рекомендациями «Деонтология медико-биологического эксперимента», а также с соблюдением правил гуманного обращения с животными «Report of the AVMA Panel on Euthanasia». Согласно общепринятым этическим нормам, все болезненные манипуляции осуществлялись под общим и местным обезболиванием.
После обработки операционного поля антисептиками, лабораторному животному, находящемуся под наркозом, выполнялись разрез кожных покровов в проекции заднего края большого вертела и послойное разведение мышц. Добравшись до тазобедренного сустава, производилось рассечение капсулы сустава и вывихивание головки бедренной кости кзади с одномоментным пересечением круглой связки. С помощью шприца в головку бедренной кости кролика вводилось 0,3–0,4 мл 96 % спирта.
На первых этапах работы, при выведении лабораторных животных из эксперимента и исследовании головок бедренных костей, было выявлено наличие некроза параартикулярных тканей вследствие продолжающегося повреждающего действия на них спирта после ушивания раны. В связи с этим модель аваскулярного некроза головки бедренной кости была усовершенствована путем использования воска для закрытия места инъекции этанолом и последующего промывания операционного поля физиологическим раствором для удаления остатков спирта. На завершающем этапе проводилось вправление головки бедренной кости во впадину с последующим послойным ушиванием раны.
При выведении лабораторных животных из эксперимента в сроки 2, 4 и 8 недель (группы I, II и III, соответственно), полученный экспериментальный материал, фиксированный в 10 % формалине, декальцинировался в специальном декальцинирующем растворе (Биодек) при температуре 37 ºС в течение 24 часов. Затем экспериментальный материал подвергался обезвоживанию в спиртах восходящей концентрации, начиная с 70 % спирта и до абсолютного. После помещения в ксилол материал подвергался заливке в парафин. Стандартная гистологическая проводка осуществлялась на аппарате «Excelsior ES» (Thermo Scientific). После проводки изготовливались парафиновые блоки с использованием заливочной станции «HistoStar» (Thermo Scientific). Серийные срезы толщиной 4–6 микрон получали на микротоме «Microm HM 325» (Thermo Scientific). Срезы окрашивались гематоксилином и эозином.
Для морфометрической обработки и создания видеоархива полученного экспериментального материала использовался микроскоп Leica DM 2500, объектив х4, х10, х20, х40, х100, окуляр х10.
Результаты исследования и их обсуждение
При макроскопическом исследовании экспериментального материала, полученного у животных I группы – через 2 недели после моделирования очага некроза по предложенной малоинвазивной методике с использованием 96 % спирта – хрящевая поверхность головки бедренной кости ровная, гладкая, без видимых дефектов, однако суставной хрящ в предполагаемой зоне аваскулярного некроза темно-серого цвета, на разрезе губчатое вещество кости неравномерное (рис. 1).
Рис. 1. Фрагмент головки бедренной кости кролика на 2 неделю после моделирования аваскулярного некроза (I группа животных)
При гистологическом исследовании экспериментального материала, полученного у животных, выведенных из эксперимента через 2 недели после воздействия спиртом, отмечено редкое расположение бесформенных костных балок с наличием небольшого количества островков энхондрального остеогенеза. В субламинарной зоне на препаратах головок бедренных костей животных I группы на фоне миелоидного костного мозга наблюдались альтеративные изменения костной ткани в виде формирования грубо-губчатой костной ткани и редкого расположения костных балок (рис. 2).
Рис. 2. Микропрепарат головки бедренной кости кролика через 2 недели после воздействия спиртом (I группа животных). Бесформенные костные балки среди миелоидного костного мозга. Окраска гематоксилин-эозином. Увеличение х 200
Через 4 недели после воздействия спиртом макропрепараты головок бедренных костей кроликов II группы сохраняли сферическую структуру головки с деформацией суставного хряща, на разрезе с участком расплавления ткани (рис. 3).
Рис. 3. Фрагмент головки бедренной кости кролика на 4 неделю после моделирования аваскулярного некроза (II группа животных)
При гистологическом исследовании головок бедренных костей животных, выведенных из эксперимента через 4 недели после введения 96 % спирта (II группа), в толще головок бедренных костей субхондральные костные пластинки имели нечеткие границы (рис. 4).
Рис. 4. Микропрепарат головки бедренной кости кролика через 4 недели после воздействия спиртом (II группа животных). Фрагменты грубогубчатой костной ткани с безостеоцитными участками. Окраска гематоксилин-эозином. Увеличение х 200
Через 1 месяц после моделирования аваскулярного некроза на микропрепаратах головок бедренных костей кроликов II группы в спонгиозе визуализировались полости, по краям которых располагались нежизнеспособные костные балки. В полостях отсутствовали костные структуры. Также наблюдались фрагменты грубогубчатой костной ткани с безостеоцитными участками и хорошо различимыми произвольно ориентированными линиями склеивания на фоне мертвой костной ткани (рис. 4).
Исследование экспериментального материала, полученного у кроликов, выведенных из эксперимента через 8 недель после введения 96 % спирта, на поверхности головки бедренной кости, в которой проводилось моделирование АНГБК по предложенной методике, показало, что головка бедренной кости лабораторных животных III группы имеет сероватый оттенок в зоне моделирования, хрящевая поверхность тусклая, шероховатая (рис. 5).
Рис. 5. Фрагменты головки бедренной кости кролика на 8 неделю после моделирования асептического некроза (III группа животных)
При гистологическом исследовании срезов головок бедренных костей лабораторных кроликов III группы через 8 недель после воздействия этанолом отмечено утолщение костных балок, а также наличие между ними нежной ретикуло-фиброзной ткани, что наглядно проиллюстрировано на рисунке 6. В имеющихся костных балках наблюдалось большое количество остеоцитов с широкими лакунами (рис. 6).
Рис. 6. Микропрепарат головки бедренной кости кролика через 8 недель после воздействия спиртом (III группа животных). Утолщенные костные балки и активное формирование костной ткани путем энхондрального остеогенеза. Окраска гематоксилин-эозином. Увеличение х 200
Заключение
Разработанная модель аваскулярного некроза головки бедренной кости является наиболее адекватной и обладает рядом преимуществ относительно других существующих экспериментальных моделей остеонекроза. Она является малотравматичной, то есть наносит меньше вреда лабораторным животным и выполняется с использованием доступа, максимально приближенного к хирургической практике при выполнении органосохраняющих оперативных вмешательств у пациентов с данной патологией.
Гистологически подтверждено, что через 4 недели после воздействия 96 % спиртом наблюдаются начальные проявления аваскулярного некроза головки бедренной кости, оптимальным сроком для дальнейшего исследования свойств и оценки эффективности новых материалов, предполагающих их дальнейшее использование в клинической практике для замещения очага некроза, являются 4 недели от момента введения спирта экспериментальным животным по предложенной схеме. Результаты проведенного экспериментального исследования доказывают эффективность предложенной модели АНГБК.