Scientific journal

Modern problems of science and education

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

Проблема метастатического колоректального рака в последнее десятилетие стала особенно актуальной, что обусловлено не только увеличением числа метастатических форм опухолей толстой и прямой кишки, но, в основном, внедрением высокотехнологичных методов лечения, которые позволили значительно улучшить результаты лечения и достичь 5-летней выживаемости. В ряду инновационных методов лечения особо следует отметить: современные схемы полихимиотерапии (FolFox, Xelox, FolFiri), применение таргетных препаратов, хирургическое лечение метастатических форм колоректального рака (в том числе и малоинвазивное), радиочастотную термоабляцию метастазов в печени [2; 4; 8].

Успехи в области лекарственной терапии метастатического колоректального рака стали возможны благодаря фундаментальным исследованиям, которые привели к прогрессу в понимании молекулярных механизмов колоректального рака и определили молекулярные мишени для направленной противоопухолевой терапии [1]. Так, в арсенале онкологов появились такие препараты, как цетуксимаб и панитумумаб – моноклональные антитела к рецептору EGER, и бевацизумаб – моноклональные антитела к рецепторам сосудистого эндотелиального фактора роста. Проводимые многочисленные исследования показывают эффективность таргетных препаратов как в монорежиме, так и при включении их в режимы химиотерапии метастатического колоректального рака [2; 8].

Важным достижением в лекарственной терапии злокачественных опухолей является возможность определения молекулярно-генетических маркеров химиочувствительности, развития побочных токсических эффектов и риска прогрессирования опухоли. Так, в настоящее время установлено, что на риск прогрессирования влияют: анэуплодия, процент клеток в S-фазе цикла, микросателлитная нестабильность, уровень тимидилатсинтетазы, уровень белков Pgp 170, MRP, LRP, мутации p27, p53, гиперэкспрессия Bcl-2, уменьшение экспрессии CD95, экспрессия эпидермальных и эндотелиальных факторов роста [6].

Молекулярными маркерами ответа на химиотерапию являются: p53, EGFR, Ki-67, p21, bcl-2 и тимидилатсинтетаза [6]. Определены и факторы, определяющие отсутствие чувствительности к химиотерапии, например для оксалиплатина и иринотекана - это тесты «cross-complementinggene ERCC1» и «topo-isomerase-1 (Topo1)» [3].

В последнее время активно изучаются и циркулирующие опухолевые клетки при злокачественных опухолях, в том числе и при колоректальном раке. Так, установлено, что при метастатических формах рака циркулирующие опухолевые клетки обнаруживаются у 70% больных, при локализованных – у 30-40%. Обнаружение циркулирующих опухолевых клеток у больных после завершения адъювантной химиотерапии свидетельствует о развитии прогрессирования заболевания в 70% случаев [5; 7]. В настоящее время устанавливается связь количества циркулирующих опухолевых клеток со стадией, клиническим течением, особенностями прогрессирования рака.

Успешное внедрение достижений фундаментальной онкологии в клиническую практику инициирует проведение новых фундаментальных исследований, которые позволят лучше понять биологическую сущность колоректальной опухоли и определят новые мишени для направленной терапии.

Цель работы – изучить некоторые биологические особенности метастатического колоректального рака.

Материал и методы. В исследование включено 48 больных колоректальным раком T1-4N0-2M0-1, находившихся на лечении в клинике ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» МЗ РФ в 2015-2016 гг. Среди больных было 48 (52,7%) женщин и 43 (47,3%) мужчины. Средний возраст пациентов на момент лечения составил 62,3 года. Опухоль локализовалась в прямой кишке у 32 (35,2%) больных, в сигмовидной кишке – у 25 (27,5%) больных, ободочной кишке – у 34 (37,4%) больных. У всех больных гистологически опухоли характеризовались как аденокарциномы различной степени дифференцировки: G1 – в 4 (4,4%) случаях, G2 – в 70 (76,9%) случаях, G3 – в 17 (18,7%) случаях. По классификации TNM выявлено следующее распределение: Т2 – 2 (2,2%) больных, Т3 – 21 (23,1%), Т4 – 68 (74,7%). Метастазы в регионарных лимфоузлах выявлены у 49 (53,8%) больных. Первично генерализованные формы с метастазами в печень (T1-4N0-2M1) были у 26 (49) больных, они составили основную группу пациентов. У 42 больных колоректальные опухоли были локализованные, без отдаленных метастазов (T1-4N0-2M0), эти пациенты составили контрольную группу. Всем больным выполнены циторедуктивные и радикальные оперативные вмешательства. У больных обеих групп исследовали содержание циркулирующих опухолевых клеток и наличие мутаций гена KRAS.

Для этого до оперативного вмешательства у больных производили забор 7,5 мл крови в пробирки CellSavePreservativeTube, содержащие антикоагулянт ЭДТА, а также реагент для сохранения жизнеспособности опухолевых клеток. Детекцию циркулирующих опухолевых клеток проводили с использованием системы CellSearchTMVeridex (Johnson&Johnson, США). Для отделения клеток крови и опухолевых от плазмы кровь смешивалась с рабочим буфером из набора реагентов CellSearch® CTCkit и центрифугировалась при ускорении 800 g в течение 10 минут. После этого образцы переносились в аппарат CellTracks® AutoPrep® System, который в автоматическом режиме, удаляя плазму крови и форменные элементы, иммуномагнитно обогащал образец микрочастицами железа, покрытыми антителами к маркерам адгезии эпителиальных клеток ЕрСАМ, СD45 и цитокератинами 8,18,19. Качество работы системы оценивали с использованием стандартного контроля СТС controlkit. Материал сканировался в анализаторе CellTracks® AnalyzerII®. С учетом морфологических характеристик и экспрессии маркеров регистрировались циркулирующие опухолевые клетки. Общее число выявленных опухолевых клеток являлось конечным результатом.

Из фиксированных в 10%-ном забуференном формалине и залитых в парафин образцов тканей опухолей, полученных после оперативного вмешательства, получали срезы толщиной 8-10 мкм. Процедура экстракции ДНК включала в себя стандартную депарафинизацию срезов. Затем образцы обрабатывали набором реагентов QIAamp® DNA FFPE Tissue Kit (QIAGENE, Германия) согласно протоколу производителя. Концентрацию выделенной из образцов ДНК измеряли на флюориметре Qubit 2.0® с использованием набора Quant-iT™ dsDNA High-Sensitivity (HS) Assay Kit (Invitrogen, США). Концентрация ДНК нормализовывалась до величины 1 нг/мкл. При помощи набора реагентов Real-Time-PCR-KRAS-7M («Биолинк», Россия) проводили определение 7 SNP-мутаций (Single Nucleotide Polymorphism) в 12 и 13 кодонах гена KRAS: G12C, G12S, G12R, G12V, G12D, G12A, G13D с использованием термоциклера Bio-Rad CFX96 (Bio-Rad, США). Статистический анализ выполняли с использованием пакетов программ Microsoft Excel 2010 и STATISTICA 8.0. Оценку различий проводили с использованием χ2-критерия и точного двухстороннего критерия Фишера, при сравнении числа ЦОК применяли критерий Манна -Уитни   для уровня статистической значимости р<0,05.

Результаты исследования

В группе пациентов с метастатическим колоректальным раком средний возраст больных составил 59,49 года. Среди больных было 32 (65,3%) женщины (средний возраст 59,35 года) и 17 (34,7%) мужчин (средний возраст 59,77 года). Опухоль локализовалась в прямой кишке у 15 (30,6%) больных, в сигмовидной кишке – у 13 (26,5%) больных, ободочной кишке – у 21 (42,9%) больных. У всех больных гистологически опухоли характеризовались как аденокарциномы различной степени дифференцировки: G1 – в 2 (4,1%) случае, G2 – в 40 (81,6%) случае, G3 – в 7 (14,3%) случаях. По классификации TNM выявлено следующее распределение: Т3 – 4 (8,2%), Т4 – 46 (92,3%). Метастазы в регионарных лимфоузлах выявлены у 38 (77,6%) больных.

Мутации гена KRAS выявлены у 13 (26,5%) больных, циркулирующие опухолевые клетки выявлены у 38 (77,6%) больных метастатическим колоректальным раком. Если рассматривать особенности метастатической колоректальной опухоли в зависимости от состояния гена KRAS и особенностей содержания циркулирующих опухолевых клеток, то получим следующие данные. При одинаковом характере распределения гистологической структуры опухоли и частоте наличия циркулирующих опухолевых клеток (табл. 1) у пациентов с метастатическим колоректальным раком с диким типом гена KRAS среднее число циркулирующих клеток в 5 раз выше, чем при мутированном гене KRAS (р=0,0010).

Таблица 1

Особенности метастатических колоректальных опухолей

в зависимости от состояния гена KRAS

Примечание: p - статистическая значимость различий между группами.

У пациентов с метастатическим колоректальным раком с наличием циркулирующих опухолевых клеток наблюдается такая же частота мутаций гена KRAS, как и у пациентов без выявленных циркулирующих опухолевых клеток (табл. 2). А вот в гистологической структуре опухолей мы нашли достоверные изменения. Так, циркулирующие опухоли клетки достоверно чаще (p=0,040) выявляются при смещении дифференцировки аденокарциномы в сторону низкодифференцированных опухолей.

Таблица 2

Особенности метастатических колоректальных опухолей в зависимости от наличия циркулирующих опухолевых клеток

Примечание: p - статистическая значимость различий между группами.

В группе пациентов с локализованным колоректальным раком без отдаленных метастазов средний возраст больных составил 62,9 года. Среди больных было 15 (35,7%) женщин (средний возраст 64,22 года) и 27 (64,3%) мужчин (средний возраст 61,71 года). Опухоль локализовалась в прямой кишке у 17 (40,5%) больных, в сигмовидной кишке – у 13 (31,0%) больных, ободочной кишке – у 12 (28,6%) больных. У всех больных гистологически опухоли характеризовались как аденокарциномы различной степени дифференцировки: G1 – в 2 (4,8%) случаях, G2 – в 29 (69,0%) случаях, G3 – в 11 (26,2%) случаях. По классификации TNM выявлено следующее распределение: Т2 – 2 (4,8%) больной, Т3 – 17 (40,5%), Т4 – 23 (54,8%). Метастазы в регионарных лимфоузлах выявлены у 11 (26,2%) больных.

Среди больных колоректальным раком без отдаленных метастазов мутации гена KRAS наблюдались у 16 (38,1%) пациентов. Наличие мутации не влияет на частоту обнаружения и среднее число циркулирующих опухолевых клеток при локализованной колоректальной опухоли (табл. 3), но влияет на дифференцировку аденокарциномы. Это проявляется в смещении дифференцировки аденокарциномы в сторону низкодифференцированных опухолей при наличии мутации гена KRAS в опухолевых клетках.

Таблица 3

Особенности колоректальных опухолей без отдаленных метастазов в зависимости от состояния гена KRAS

Примечание: p - статистическая значимость различий между группами.

Циркулирующие опухолевые клетки выявлены у 29 (69,0%) больных колоректальным раком без отдаленных метастазов. Результаты исследования показали, что при локализованном колоректальном раке с наличием циркулирующих опухолевых клеток достоверно чаще встречается мутация гена KRAS по сравнению с локализованными опухолями без циркулирующих опухолевых клеток (табл. 4). По остальным показателям в этих подгруппах больных достоверных различий не было.

Таблица 4

Особенности колоректальных опухолей без отдаленных метастазов в зависимости от наличия циркулирующих опухолевых клеток

Примечание: p - статистическая значимость различий между группами.

Обсуждение. Основную часть пациентов с первично метастатическим колоректальным раком, в отличие от пациентов с локализованной колоректальной опухолью, составили женщины (2/3 пациентов), причем по возрасту они были на 5 лет моложе, чем при локализованной опухоли. При первично метастатическом колоректальном раке в 1,5 раза чаще, чем при локализованном, опухоль располагалась в ободочной кишке. Метастатические колоректальные опухоли были, в основном, и местнораспространенными: выходили за пределы кишечной стенки (92,3%) и имели метастазы в регионарных лимфоузлах (76,9%). Колоректальные опухоли без отдаленных метастазов имели и меньшую степень распространения: опухоль локализовалась только в пределах кишечной стенки у 45,4% больных, выходила за пределы кишечной стенки у 54,6% больных. Локализованные колоректальные опухоли в большинстве случаев (72,7%) были без отдаленных метастазов. В отношении степени дифференцировки опухоли мы не нашли отличий между группами метастатического и локализованного колоректального рака: в обеих группах преобладали G2 аденокарциномы (69,0-81,6%), случаи G1 аденокарциномы были единичны.

Мутации гена KRAS выявлены у трети больных колоректальным раком (в 26,5% случаев метастатической опухоли и в 38,1% случаев локализованной опухоли).

У пациентов с метастатическим колоректальным раком с диким типом гена KRAS среднее число циркулирующих клеток в 5 раз выше, чем при мутированном гене KRAS (р<0,05). При диком типе гена KRAS частота выявления циркулирующих клеток в крови больных выше при метастатических опухолях (77,7%), чем при локализованных (65,4%).

При локализованной колоректальной опухоли с диким типом гена KRAS выше частота G2 аденокарциномы (92,3%) по сравнению с метастатическим раком (77,8%), при котором наблюдается смещение дифференцировки аденокарциномы в сторону низкодифференцированных опухолей. При смещении дифференцировки аденокарциномы в сторону низкодифференцированных опухолей при метастатическом раке наблюдается достоверное увеличение частоты выявления циркулирующих опухолевых клеток.

Колоректальные опухоли с мутированным геном KRAS отличаются по дифференцировке аденокарцином в зависимости от распространенности опухоли. Так, при локализованной форме опухоли в половине случаев наблюдались низкодифференцированные аденокарциномы, при этом встречались и умеренно- и высокодифференцированные аденокарциномы. При первично метастатических опухолях гистологически опухоли были представлены, в основном, умереннодифференцированными аденокарциномами.

Циркулирующие опухолевые клетки выявлены нами у 3/4 больных колоректальным раком. При этом среднее их число в 3,7 раза было выше при опухолях с отдаленными метастазами. Полученные нами данные согласуются с результатами других исследований, выявившими циркулирующие опухолевые клетки у 70% больных метастатическими формами рака. Кроме того, в настоящее время установлена связь между выявлением циркулирующих опухолевых клеток и течением заболевания, развитием прогрессирования опухоли [5; 9]. Эти данные подтверждают высокий риск развития метастазов опухоли при наличии циркулирующих опухолевых клеток в периферической крови. Целесообразно использование циркулирующих опухолевых клеток как фактора прогноза клинического течения опухоли и эффективности терапии, что уже отражено в рекомендациях ASCO и FDA.

В подгруппе больных локализованным колоректальным раком с наличием циркулирующих опухолевых клеток в 2 раза чаще встречалась мутация гена KRAS по сравнению с локализованными опухолями без циркулирующих опухолевых клеток и с метастатическими раками. Эти данные нуждаются в дальнейшем исследовании.

Таким образом, метастатические колоректальные опухоли имеют молекулярно-биологические особенности, которые возможно учитывать для прогнозирования клинического течения заболевания и при планировании лечения.

Выводы

1. Первично-метастатические формы колоректального рака преимущественно наблюдаются у женщин на 5 лет моложе, чем при локализованной опухоли. Первичная опухоль в 1,5 раза чаще располагается в ободочной кишке и имеет и местнораспространенный характер (выходит за пределы кишечной стенки (92,3%), и метастазы в регионарных лимфоузлах (76,9%)).
2. При метастатическом колоректальном раке наблюдается смещение дифференцировки аденокарциномы в сторону низкодифференцированных опухолей, что сопровождается достоверным увеличением частоты выявления и среднего числа (в 3,7 раза) циркулирующих опухолевых клеток.
3. Метастатический колоректальный рак с диким типом гена KRAS имеет более высокий метастатический потенциал: в 1,2 раза выше частота выявления и в 5 раз выше среднее число циркулирующих опухолевых клеток (р<0,05).