Чрезмерное и длительное употребление алкоголя является экономической, социальной и медицинской проблемой всех стран мира, является одной из глобальных причин утраты трудоспособности и лежит прямо или косвенно в возникновении 5 % болезней. Статистически показано, что между злоупотреблением алкоголя и развитием не менее 60 патологий, есть прямая корреляционная связь, а в генезе более чем 200 заболеваний имеется опосредованная. Неумеренное потребление этанолсодержащих напитков, как в количественном отношении, так и во временном, относится к закономерностям увеличения смертности населения. Во всем мире ежегодно алкоголь является основой летальных исходов в более 3 млн случаев, что составляет до 6 % от общей летальности. Трудно найти органы и ткани организма человека, не затронутого так или иначе острыми и хроническими злоупотреблениями этанола или его суррогатами. Помимо нарушений деятельности центральной и периферической нервной системы к действию алкоголя высокую чувствительность имеет печень. Это связано с тем, что данный орган первый стоит на пути токсиканта и отвечает за метаболизм этанола, при этом образование высокореакционного промежуточного продукта ацетальдегида и инициирует свободно-радикальные процессы, приводящие к повреждению клеточных мембран гепатоцитов. Алкоголь чувствительными являются также сердечно-сосудистая система, поджелудочная железа, мышцы, иммунная система [1, 6¸7, 10].
Ранее экспериментально было установлено, что кратковременное (5 суток), так и длительное введение (30 и 60 дней) этанола приводит к развитию токсического поражения печени, окислительного стресса, нарушению механизмов врожденного иммунитета, при этом кратковременное принудительное введение этанола вызывают изменения реактивного характера, то длительная интоксикация приводит к метаболическим нарушениям, требующим фармакологической коррекции [11].
В последние несколько лет исследованиями различных авторов установлена несомненная роль эритроцитов в регуляции различных метаболических процессов не только в условиях нормы, но, в первую очередь, в условиях патологии [3, 9]. В то же время практически отсутствуют данные о влиянии алкогольной интоксикации на структурные компоненты мембраны эритроцитов.
Целью настоящего исследования стало изучение содержания белков и липидов мембраны эритроцитов при острой и хронической интоксикации этанолом.
Материал и методы исследования. Опыты проведены на 67 здоровых крысах-самцах породы Вистар массой 150–200 г., содержание и забой которых проводили с соблюдением принципов, изложенных в Конвенции по защите позвоночных животных (г. Страсбург, Франция, 1986) и согласно МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 г. Ежедневное введение 20 % раствора этанола в дозе 3 мл/кг через 24 часа проводили принудительно, внутрижелудочно. Всех животных делили на 4 группы по 16–17 особей в каждой: 1-я группа (контрольная); 2-й, 3-й и 4-й группам этанол вводили соответственно в течение 5, 30 и 60 дней. Забой осуществляли через 24 часа после последней интоксикации.
Эритроциты выделяли из 5 мл гепаринизированной крови, после ее 30-минутного отстаивания при 37 ºС в 10 мМ Na-фосфатном буфере (рН=7,4), содержащем 0,9 % хлорида натрия и 3 % декстрана Т-500. После центрифугирования и удаления надосадочной жидкости из эритроцитарной массы получали мембраны красных клеток крови [14], в которых определяли тонкослойной хроматографией липиды [4] и методом электрофореза в вертикальных пластинах полиакриламидного геля белки [15].
С помощью пакета компьютерных программ Microsoft Excel, 2010, полученный цифровой материал подвергали статистической обработке по общепринятым критериям вариационно-статистического анализа с вычислением средних величин (M), ошибки средней арифметической (m). Существенность различий оценивали по U-критерию. Статистически значимыми считали различия с p < 0,05.
Результаты и обсуждение. У животных с 5-кратным введением этанола не выявлено изменений в содержании белков мембраны эритроцитов. Введение этанола в течение 30 дней приводило к снижению в эритроцитарной мембране уровня α- и β-спектрина, актина и повышению тропомиозина при нормальном содержании остальных исследованных мембранных белков. Введение этанола в течение 60 дней по сравнению с 30-дневной интоксикацией дополнительно снижало представительность анкирина и актина, повышало содержание паллидина и в еще большей степени тропомиозина (табл. 1).
Таблица 1
Содержание белков в мембране эритроцитов при острой и хронической интоксикации этанолом (M+m)
|
Показатели |
1 |
2 |
3 |
4 |
|
Контроль |
Введение этанола |
|||
|
5 дней |
30 дней |
60 дней |
||
|
α-спектрин |
108,3±4,2 |
109,2±3,1 |
91,2±2,4*1,2 |
90,5±2,7*1,2 |
|
β-спектрин |
103,1±3,3 |
105,0±2,8 |
93,7±2,8*1,2 |
92,5±3,4*1,2 |
|
Анкирин |
89,0±3,0 |
91,2±2,2 |
90,4±3,7 |
74,2±2,7*1-3 |
|
АТБ |
171,6±4,2 |
172,3±3,8 |
169,5±4,2 |
169,8±3,0 |
|
4.1 |
70,4±3,2 |
68,3±2,4 |
69,8±2,7 |
71,2±2,6 |
|
Паллидин |
92,1±4,1 |
90,2±3,0 |
94,1±3,9 |
99,7±2,1*1-3 |
|
4.5 |
79,8±3,1 |
74,2±2,5 |
77,1±1,9 |
78,0±2,5 |
|
Дематин |
91,2±3,1 |
89,1±2,4 |
88,6±3,4 |
90,1±2,8 |
|
Актин |
88,1±3,2 |
89,3±2,2 |
73,1±2,1*1,2 |
68,3±2,2*1-3 |
|
Г-3-ФД |
54,3±2,0 |
55,3±2,1 |
54,0±2,5 |
56,2±2,3 |
|
Тропомиозин |
63,7±3,1 |
61,8±2,7 |
70,3±1,8*1,2 |
84,5±2,3*1-3 |
|
Г-S-Т |
61,2±2,5 |
63,1±1,9 |
62,4±2,7 |
62,8±3,0 |
Кратковременная интоксикация этанолом снижала уровень в мембране эритроцитов фосфатидилхолина (ФХ), фосфатидилинозитола (ФИ), сфингомиелина (СМ), повышала содержание лизофосфатидилхолина (ЛФХ), холестерола (Х), триацилглицеролов (ТАГ), суммы моно- и диацилглицеролов (МАГ, ДАГ) и неэстерифицированных жирных кислот (НЭЖК), при нормальном содержании фосфатидилэтаноламина (ФЭ), фосфатидилсерина (ФС), суммы ЛФХ, ФХ, ФЭ, ФС и ФИ (глицерофосфолипиды – ГФЛ), суммы ГФЛ и СМ (фосфолипиды – ФЛ) и эфиров холестерола (ЭХ). Введение этанола в течение 30 дней по сравнению с кратковременной интоксикацией дополнительно снижало представительность ФЭ и ФЛ, в еще большей степени снижало уровень ФИ, СМ и повышало ЛФХ и Х. Интоксикация этанолом в течение 60 дней по сравнению с 30-дневным введением дополнительно снижала представительность ФХ, ФИ, СМ и повышала содержание ЛФХ, ДАГ+МАГ, НЭЖК (табл. 2).
Таблица 2
Содержание липидов в мембране эритроцитов при острой и хронической интоксикации этанолом (M+m)
|
Показатели |
1 |
2 |
3 |
4 |
|
Контроль |
Введение этанола |
|||
|
5 дней |
30 дней |
60 дней |
||
|
ФХ |
24,0±0,7 |
22,6±0,2*1 |
22,8±0,4*1 |
21,2±0,4*1-3 |
|
ЛФХ |
3,9±0,05 |
4,2±0,1*1 |
5,0±0,05*1,2 |
5,6±0,05*1-3 |
|
ФЭ |
24,6±1,0 |
24,1±0,2 |
23,0±0,4*1,2 |
22,0±1,0*1,2 |
|
ФС |
19,7±0,7 |
18,8±0,4 |
19,0±0,2 |
19,2±0,5 |
|
ФИ |
4,6±0,05 |
4,4±0,1*1 |
4,1±0,1*1,2 |
3,9±0,05*1-3 |
|
ГФЛ |
76,6±2,2 |
74,1±2,4 |
73,9±1,6 |
72,5±2,0 |
|
СМ |
12,2±0,5 |
11,1±0,3*1 |
10,2±0,4*1,2 |
8,9±0,2*1-3 |
|
ФЛ |
88,6±2,0 |
85,2±2,7 |
84,1±1,4*1 |
82,9±1,8*1 |
|
Х |
44 ,8±2,1 |
47,8±0,3*1 |
52,4±1,2*1,2 |
54,9±1,2*1,2 |
|
ЭХ |
40,0±2,2 |
39,8±0,5 |
41,2±1,5 |
39,3±0,9 |
|
ТАГ |
14,5±0,7 |
16,1±0,4*1 |
15,9 ±0,6*1 |
16,2±1,1*1 |
|
ДАГ+МАГ |
9,6±0,2 |
10,5±0,1*1 |
10,1±0,2*1 |
11,4±0,3*1-3 |
|
НЭЖК |
2,9±0,05 |
3,1±0,1*1 |
3,2±0,05*1 |
3,5±0,07*1-3 |
При изучении соотношения фракций мембранных липидов определено, что кратковременное поступление этанола повышает соотношение Х+ЭХ/ФЛ, 30-дневное введение повышает отношение ЛФХ/ФХ, в еще большей степени Х+ЭХ/ФЛ и снижает соотношение СМ/ФХ. Интоксикация этанолом в течение 60 дней снижает отношение СМ/ГФЛ, ФХ/ФС, ФХ+ФЭ/ФС+ФИ, в еще большей степени повышает соотношение ЛФХ/ФХ (табл. 3).
Таблица 3
Соотношение фракций липидов в мембране эритроцитов при острой и хронической интоксикации этанолом (M+m)
|
Показатели |
1 |
2 |
3 |
4 |
|
Контроль |
Введение этанола |
|||
|
5 дней |
30 дней |
60 дней |
||
|
ЛФХ/ФХ |
0,16±0,01 |
0,19±0,02 |
0,22±0,02*1 |
0,26±0,01*1-3 |
|
СМ/ФХ |
0,51±0,02 |
0,49±0,02 |
0,45±0,01*1,2 |
0,42±0,02*1,2 |
|
СМ/ГФЛ |
0,16±0,02 |
0,15±0,01 |
0,14±0,02 |
0,12±0,01*1,2 |
|
ФХ/ФС |
1,22±0,03 |
1,2±0,03 |
1,2±0,04 |
1,1±0,04*1-3 |
|
ФХ+ФЭ/ ФС+ФИ |
2,0±0,03 |
2,0±0,04 |
1,98±0,03 |
1,87±0,03*1-3 |
|
Х+ЭХ/ФЛ |
0,96±0,03 |
1,03±0,02*1 |
1,11±0,03*1,2 |
1,14±0,02*1,2 |
Выявленные данные указывают на существенные изменения, пропорциональные длительности поступления в организм этанола, со стороны периферических белков, ответственных за структурообразование и стабилизацию мембраны эритроцитов (α- и β-спектрин, анкирин, паллидин), формообразование и гибкость мембраны (актин, тропомиозин). Следует отметить, что введение алкоголя не влияет на уровень белков, являющихся интегральными и ответственных за внутриклеточный метаболизм (АТБ, Г-3-ФД, Г-S-Т, белок полосы 4.5). Установленные изменения содержания и соотношения фракций липидов, составляющих двойной липидный каркас клеточной мембраны, несут ответственность за упорядочивание белковых макромолекул и нормальный метаболизм эритроцитов. Выявленные расстройства могут привести к значительным нарушениям функциональных свойств красных клеток крови [12, 13].
Наиболее вероятной причиной нарушений белково-липидного спектра мембраны эритроцитов при длительном введении этанола является интенсификация свободно-радикальных процессов, результатом чего является возрастание их чувствительности к перекисным процессам. Чрезмерная активация процессов ПОЛ сопровождается существенными изменениями состава, соотношения и степени окисленности мембранных глицерофосфолипидов (в большей степени ФХ и ФЭ), сфингофосфолипидов и гликосфинголипидов, что в конечном итоге приводит к изменению физико-химических свойств липидного бислоя клеточных мембран и снижению активности фосфолипидзависимых энзиматических систем. В условиях гиперактивации свободно-радикальных процессов закономерно и в первую очередь уменьшаются фосфолипиды, содержащие в своем составе полиненасыщенные жирные кислоты. Кроме этого, избирательная делипидизация цитоплазматических мембран эритроцитов вызывает увеличение соотношения между содержанием холестерола и фосфолипидов в бислое клеточных мембран, что в конечном итоге приводит к нарушению функции эритроцитов [2, 8].
Поскольку процессы ПОЛ взаимосвязаны с важнейшими физико-химическими свойствами мембран (проницаемость, вязкость, фазовое состояние), то развитие различных патологий сопровождается молекулярными изменениями плазматических мембран клеток. Одними из наиболее чувствительных являются мембраны эритроцитов, способных достаточно быстро изменять состав и в условиях нормального функционировании организма. Компенсаторные изменения в белково-липидном спектре эритроцитов направлены на поддержание жидкокристаллической структуры мембраны, барьерных, рецепторных, сорбционных, транспортных и других свойств и проницаемости мембраны. Однотипность адаптивных биохимических реакций на уровне белков и липидов является, очевидно, одним из основных путей эволюции живого, обусловливающих отсутствие качественных различий ответа организма на действие внешних факторов. Однако в связи с неодинаковой чувствительностью параметров физико-химической системы регуляции ПОЛ и способностью их к восстановлению масштаб и характер взаимосвязей между тесно скоординированными в норме показателями может существенно различаться не только в зависимости от природы и интенсивности внешнего фактора, но и от исходного физиологического состояния биологической системы, что обусловливает те количественные различия, которые обнаруживаются не только в разных исследованиях, но и зависят от времени начала действия фактора [5, 8, 12].
Заключение. Острая кратковременная интоксикация этанолом не привела к сдвигу от нормы содержания белков мембраны эритроцитов, при этом изменился лишь липидный состав клеточной мембраны в сторону увеличения холестерола и его эфиров. Хроническая интоксикация этанолом изменила белковый и липидный состав мембраны эритроцитов, однако некоторые показатели остались в норме при 30-дневном его поступлении. 60-дневное отравление этанолом привело к значительному отклонению от нормы содержание и соотношение белков и липидов мембраны эритроцитов, требующее проведения фармакологической коррекции.